原理：試樣中的維生素 D2 或維生素 D3經(jīng)氫氧化鉀乙醇溶液皂化（含淀粉試樣先用淀粉酶酶解）、提取、凈化、濃縮后，用正相高效液相色譜半制備，反相高效液相色譜 C18柱分離，根據(jù)維生素 D 的特征吸收波長，采用外標法定量。

分析步驟：

試樣處理：稱取一定量的試樣，加入適量淀粉酶（若試樣含淀粉），在一定條件下酶解后，加入氫氧化鉀乙醇溶液進行皂化。皂化完成后，用正己烷等溶劑提取，將提取液經(jīng)硅膠固相萃取柱凈化，濃縮至近干，再用正相高效液相色譜流動相溶解，經(jīng)正相高效液相色譜半制備，收集含維生素D 的餾分，濃縮后用反相高效液相色譜流動相復溶，供反相高效液相色譜分析。

標準曲線制備：配制不同濃度的維生素 D2 或維生素 D3標準溶液，按照試樣處理步驟同樣操作，得到不同濃度的標準工作液。將標準工作液注入高效液相色譜儀，以峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。

樣品測定：將制備好的試樣溶液注入高效液相色譜儀，測定其峰面積，根據(jù)標準曲線計算試樣中維生素 D2 或維生素 D3的濃度。

結果計算：根據(jù)公式計算試樣中維生素 D2（或維生素 D3）的含量，公式為 X=c×V×100/m。其中，X為試樣中維生素 D2（或維生素 D3）的含量，單位為微克每百克（μg/100g）；c 為根據(jù)標準曲線計算得到的試樣中維生素D2（或維生素 D3）的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V 為試樣定容體積，單位為毫升（mL）；m為試樣質量，單位為克（g）。

精密度：在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的差值不得超過算術平均值的 15%。

檢出限與定量限：當取樣量為 10g 時，維生素 D2 或維生素 D3 的檢出限為 0.7μg/100g，定量限為3μg/100g。