原理：試樣中的煙酸、葉酸用水 - 甲醇 - 乙酸混合溶液提取，將濾液注入高效液相色譜反相柱上進(jìn)行分離，用紫外檢測(cè)器在280nm 波長(zhǎng)處定量測(cè)定。

主要試劑和儀器：

試劑：包括甲醇、三、冰乙酸、己烷磺酸鈉、碳酸鈉溶液等。需配制煙酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液、葉酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液、煙酸和葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，以及提取液和磷酸緩沖液等。

儀器：實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備、超純水裝置、帶自動(dòng)進(jìn)樣器和紫外可調(diào)波長(zhǎng)檢測(cè)器的高效液相色譜儀。

試樣制備：選取有代表性的樣品至少 500g，四分法縮減至 100g，磨碎，全部通過 0.28mm孔篩，混勻，裝入密閉容器中，避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)溶液制備：稱取試樣維生素預(yù)混料 0.5-1g 或復(fù)合預(yù)混料 1-5g，至 0.0001g，置于 100mL棕色容量瓶中，加 10mL 碳酸鈉溶液，浸濕試樣，加 70mL 提取液混勻，于超聲波水浴上振蕩提取15min，用提取液定容至刻度，混合均勻，過濾或離心，再經(jīng) 0.45μm 過濾膜過濾至帶蓋小瓶中，調(diào)整該試驗(yàn)溶液的濃度為5μg/mL，供高效液相色譜分析用。

色譜條件：

反相離子對(duì)色譜條件：柱長(zhǎng) 25cm、內(nèi)徑 4.0mm 不銹鋼柱，固定相為 ODS（C18），粒度 5μm。移動(dòng)相為取500mL 去離子水，加 10mL 冰乙酸，1.3mL 三，一小瓶 20mL 己烷磺酸鈉，用去離子水定容至 1L，調(diào)節(jié) pH 為3.2，過 0.45μm 濾膜，取上述溶液 850mL 與 150mL 甲醇混合，脫氣。流速為 1.0mL/min，溫度30℃，進(jìn)樣量 20μL，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，使用波長(zhǎng) 275nm。

反相色譜條件：柱長(zhǎng) 25cm，內(nèi)徑 4mm 不銹鋼柱，固定相為 Lichrospher CH-8/11，粒度5μm。移動(dòng)相為 2% 乙腈磷酸緩沖液，流速 1.4mL/min，室溫，進(jìn)樣體積 20μL，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，使用波長(zhǎng)280nm。

定量測(cè)定：按高效液相色譜儀說明書調(diào)整儀器操作參數(shù)和靈敏度，色譜峰分離度符合要求。用兩次以上相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校正。向色譜柱注入相應(yīng)的煙酸、葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和試驗(yàn)溶液，得到色譜峰面積響應(yīng)值，用外標(biāo)法定量測(cè)定。

結(jié)果計(jì)算：計(jì)算公式為 ω=Pi×V×ρst×Vst/(Pst×m×Vi)，式中 ω為每千克試樣中含煙酸或葉酸的量（mg），m 為試樣質(zhì)量（g），V 為提取液的總體積（mL），ρst為標(biāo)準(zhǔn)溶液中煙酸或葉酸濃度（μg/mL），Vst 為煙酸或葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積（μL），Vi為從試驗(yàn)溶液中分取的進(jìn)樣體積（μL），Pst 為與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積相應(yīng)的峰面積響應(yīng)值，Pi為與從試驗(yàn)溶液中分取的進(jìn)樣體積相應(yīng)的峰面積響應(yīng)值。平行測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留有效數(shù) 3 位。

允許差：同一分析者對(duì)同一試樣同時(shí)兩次平行測(cè)定所得結(jié)果相對(duì)偏差≤10%。