原理：采用固相萃取法對試樣提取液中的維生素 B12 進行富集并去除部分雜質，再通過高效液相色譜分析測定維生素 B12的含量。

試劑與材料：除非另有規(guī)定，本標準中所用試劑均為分析純，實驗用水均為實驗室一級用水，電導率（25℃）為0.01mS/m。

儀器設備：需使用高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）、固相萃取裝置、離心機、渦旋混合器等。

樣品前處理：稱取 2.0g（至 0.01g）試樣，置于 50mL 具塞離心管中，對于固體或半固體樣品，加入 10mL水，對于液體樣品，直接取適量樣品。再加入 0.5mL 乙腈，渦旋混勻，待凈化。

固相萃取凈化：將上述處理后的樣品溶液通過合適的固相萃取柱（如 C18柱等，具體根據(jù)實際情況選擇）。先讓樣品溶液緩慢通過柱子，使維生素 B12 吸附在柱填料上，然后用適當?shù)牧芟匆海ㄈ绮缓S生素 B12的緩沖溶液等）淋洗柱子，去除雜質，Zui后用洗脫液（如甲醇 - 水混合溶液等，具體根據(jù)柱子和樣品情況確定）將維生素 B12從柱子上洗脫下來，收集洗脫液，供高效液相色譜分析。

高效液相色譜分析：根據(jù)儀器條件，選擇合適的色譜柱（如 C18 色譜柱，250mm×4.6mm，5μm），流動相（如甲醇- 水 - 乙酸銨緩沖溶液等，具體比例需優(yōu)化），設定流速（如 1.0mL/min）、檢測波長（維生素 B12 通常在 361nm波長處有吸收，可選擇此波長進行檢測）等參數(shù)。將標準品和處理好的樣品溶液分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

結果計算：根據(jù)標準品的色譜峰面積和濃度繪制標準曲線，再根據(jù)樣品的色譜峰面積，從標準曲線上查得樣品溶液中維生素 B12的濃度，進而計算出保健食品中維生素 B12 的含量。計算公式為：\(X=\frac{c\timesV\times f}{m\times1000}\)，其中X為試樣中維生素B12 的含量（μg/g 或 μg/L），c為從標準曲線上查得的樣品溶液中維生素B12 的濃度（ng/mL），V為樣品定容體積（mL），f為稀釋倍數(shù)，m為試樣質量（g）或體積（mL）。

方法檢出限：使用固相萃取法處理樣品時，取樣量為 2.0g，方法的檢出限為 1.0μg/g。