GB 5413.14-2010《食品安全國家標準 嬰幼兒配方食品和乳品中維生素 B??的測定》已于 2022 年 12 月 30日被 GB 5009.285-2022 替代。該標準的第一法為微生物法（萊士曼氏乳酸桿菌法），適用于嬰幼兒配方食品和乳品中維生素B??的定量分析。以下是其核心技術要點及操作規(guī)范：

一、檢測原理

利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillusleichmannii）對維生素 B??的特異性需求，在不含維生素B??的培養(yǎng)基中，菌株的生長量（透光率或吸光度）與樣品中維生素 B??的含量呈正比。通過標準曲線法計算樣品中維生素B??的含量。

二、主要儀器與試劑

1. 儀器設備：

2. 恒溫培養(yǎng)箱（36±1℃）

3. 分光光度計（550 nm 波長）

4. 高壓滅菌鍋、離心機、pH 計等

5. 試劑與材料：

6. 培養(yǎng)基：乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、維生素 B??測定用培養(yǎng)基（不含維生素 B??）

7. 菌種：萊士曼氏乳酸桿菌（需定期傳代活化，確保活性）

8. 提取液：磷酸氫二鈉、偏重亞鈉、檸檬酸混合溶液（用于樣品水解）

9. 標準品：維生素 B??標準品（純度≥99%）

三、分析步驟

1. 菌種活化與菌懸液制備

菌種復蘇：將凍干菌種接種至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng) 24-48 小時，連續(xù)傳代 2-3 次至活力旺盛。

菌懸液制備：取活化后的菌液離心洗滌，用生理鹽水調整透光率至 60%-80%（550 nm 波長）。

2. 樣品前處理

稱樣與提?。悍Q取含維生素 B??約 50-100 ng 的樣品，加入磷酸氫二鈉 - 偏重亞鈉 -檸檬酸混合溶液，121℃水解 10 分鐘，冷卻后調 pH 至 4.5±0.2，定容過濾。

稀釋：濾液經進一步稀釋至維生素 B??濃度約 0.01-0.02 ng/mL，確保偏重亞鈉濃度＜0.03mg/mL。

3. 標準曲線制作

梯度濃度配制：使用 0.01 ng/mL 和 0.02 ng/mL 的標準工作液，按表 1 配制 9個標準管（S1-S10），含維生素 B??濃度 0-0.1 ng / 管。

滅菌與接種：標準管和樣品管經 121℃滅菌 5 分鐘后，接種菌懸液（S1 管除外），36℃培養(yǎng) 19-20小時。

4. 測定與計算

透光率檢測：培養(yǎng)結束后，以未接種空白管（S1）為對照，測定各管透光率（550 nm），并繪制標準曲線。

結果計算：\(X= \frac{C_x \times f}{m \times 1000} \times100\)式中：X —試樣中維生素 B??含量（μg/100 g）；\(C_x\) —試樣溶液濃度平均值（ng）；f —稀釋倍數；m —試樣質量（g）。

四、方法性能

1. 檢出限：0.1 μg/100 g。

2. 精密度：重復性條件下兩次測定結果的差值不得超過算術平均值的 10%。

3. 回收率：優(yōu)化后回收率通常在 80%-110% 之間，需通過加標回收驗證基質干擾。

五、注意事項

1. 菌種活性控制：

2. 首次使用前需連續(xù)傳代 2-3 次，確保菌株活力；傳代次數建議不超過 5 次。

3. 菌懸液制備時需徹底洗滌，避免殘留培養(yǎng)基中的維生素 B??干擾。

4. 基質干擾處理：

5. 復雜樣品（如乳蛋白深度水解配方）需通過空白試驗或加標回收驗證基質效應。

6. 偏重亞鈉可能促進菌株生長，需在標準溶液中添加同等濃度以抵消影響。

7. 實驗環(huán)境要求：

8. 玻璃器皿需高溫滅菌（250℃，4 小時）以去除殘留維生素 B??。

9. 整個過程需避光操作，避免維生素 B??光解。

10. 標準曲線驗證：

11. 標準曲線需覆蓋 0.01-0.1 ng / 管范圍，且Zui高濃度管透光率兩次測定差值應＜2%。

12. 試樣管透光率需落在標準曲線 S3-S10 范圍內，否則需重新稀釋。

六、標準替代與更新

GB 5413.14-2010 已被 GB 5009.285-2022 替代，新標準增加了液相色譜法（第一法）和液相色譜- 質譜法（第二法），并優(yōu)化了微生物法（第三法）的前處理步驟和檢出限。建議優(yōu)先使用現行標準 GB5009.285-2022 進行檢測。