GB 5009.154-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素 B6 的測定》第一法為高效液相色譜- 熒光檢測法，適用于添加了維生素 B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）的食品中維生素 B6的定量分析。以下是該方法的核心技術(shù)要點及操作規(guī)范：

一、檢測原理

試樣經(jīng)提取、酶解（含淀粉試樣）、酸堿調(diào)節(jié) pH 等前處理后，通過 C18 色譜柱分離，采用熒光檢測器在激發(fā)波長 293nm、發(fā)射波長 395 nm 下檢測，外標(biāo)法定量測定維生素 B6各組分的含量。該方法通過優(yōu)化色譜條件（如流動相組成）和前處理步驟，實現(xiàn)對復(fù)雜基質(zhì)中維生素 B6 的精準(zhǔn)測定。

二、主要儀器與試劑

1. 儀器設(shè)備：

2. 高效液相色譜儀（配備熒光檢測器）

3. 色譜柱：C18 柱（規(guī)格通常為 4.6 mm×150 mm，5 μm）

4. 天平（感量 0.01 mg）、pH 計、離心機(jī)、超聲波振蕩器等

5. 試劑與材料：

6. 提取液：甲醇、水、乙酸鋅、亞鐵（用于沉淀蛋白）

7. 酶解試劑：α- 淀粉酶（用于含淀粉試樣的酶解）

8. 流動相：甲醇 - 辛烷磺酸鈉 - 三混合溶液（用冰乙酸調(diào) pH 至 3.0±0.1）

9. 標(biāo)準(zhǔn)品：吡哆醇、吡哆醛、雙吡哆胺（純度≥99%）

三、分析步驟

1. 樣品前處理

含淀粉試樣：

固體試樣：稱取 5 g（至 0.01 g），加入 45-50℃水 25 mL，混勻后加入 0.5 g α- 淀粉酶，充氮后于50-60℃酶解 30 分鐘，冷卻至室溫。

液體試樣：稱取 20 g（至 0.01 g），直接加入 0.5 g α- 淀粉酶，酶解條件同上。

不含淀粉試樣：

固體試樣：稱取 5 g，加水 25 mL，靜置 5-10 分鐘；液體試樣稱取 20 g，直接靜置。

后續(xù)處理：

用調(diào)節(jié) pH 至 1.7±0.1，放置 1 分鐘后用氫氧化鈉調(diào)至 pH 4.5±0.1，超聲振蕩 10 分鐘，定容至 50mL，過濾后取濾液經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾，待測。

2. 色譜條件

流動相：甲醇 50 mL、辛烷磺酸鈉 2.0 g、三 2.5 mL，用水溶解并定容至 1000 mL，冰乙酸調(diào) pH 至3.0±0.1。

流速：1 mL/min

柱溫：30℃

檢測波長：激發(fā)波長 293 nm，發(fā)射波長 395 nm

進(jìn)樣量：10 μL

3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（濃度范圍 0.10-1.00μg/mL），依次進(jìn)樣測定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4. 試樣測定

取處理后的試樣溶液注入色譜儀，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算維生素 B6 各組分的濃度。

四、結(jié)果計算與方法性能

1. 計算公式：Xi=m×1000ρ×V×100
   式中：Xi —試樣中維生素 B6 各組分含量（mg/100 g）；ρ —試樣溶液中維生素 B6 濃度（μg/mL）；V —樣液總體積（mL）；m —試樣質(zhì)量（g）。

2. 總維生素 B6 含量：X=X醇+X醛×1.012+X胺×1.006
   式中：X醇、X醛、X胺分別為吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的含量（mg/100g）。

3. 方法性能：

4. 檢出限：當(dāng)取樣量為 5.00 g 時，吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的檢出限均為 0.02 mg/100 g，定量限均為0.05 mg/100 g。

5. 精密度：重復(fù)性條件下兩次測定結(jié)果的差值不得超過算術(shù)平均值的 15%。

五、注意事項

1. 基質(zhì)干擾：復(fù)雜樣品（如乳蛋白深度水解配方粉）可能存在基質(zhì)效應(yīng)，需通過空白試驗或加標(biāo)回收驗證。

2. 避光操作：維生素 B6 對光敏感，前處理及檢測過程應(yīng)避免強(qiáng)光照射。

3. 流動相配制：流動相需嚴(yán)格調(diào)節(jié) pH 至 3.0±0.1，并經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾，避免色譜柱堵塞。

4. 酶解控制：含淀粉試樣的酶解溫度和時間需嚴(yán)格控制，確保淀粉充分水解。

六、標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)行有效性

GB 5009.154-2016 已于 2024 年 3 月 6 日被 GB 5009.154-2023替代。新標(biāo)準(zhǔn)增加了液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法等方法，并對前處理步驟、色譜條件和檢出限進(jìn)行了優(yōu)化。若需檢測其他類型食品中的維生素B6，建議優(yōu)先參考現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn) GB 5009.154-2023。