二、酶的選擇

1．酶的種類

    構(gòu)成植物細胞壁的三個主要成分是：①纖維素，占細胞壁干重的25 ％至50％不等；②半纖維素，平均約占細胞壁干重的53％左右；③果膠質(zhì)，一般占細胞壁的5％。

    分離原生質(zhì)體Zui常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。 纖維素酶是從綠色木霉中提取的一種復(fù)合酶制劑，主要含有纖維素酶c；，作用于天然的和結(jié)晶的纖維素，具有分解天然纖維素的作用，還含纖維素酶cx，作用于定形的纖維素，可分解短鏈纖維素，另含有纖維素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，總體作用是降解纖維素，得到裸露的原生質(zhì)體。 果膠酶是從根霉中提取的，使細胞間的果膠質(zhì)降解，把細胞從組織內(nèi)分離出來。半纖維素酶制劑可以降解半纖維素為單糖或單糖衍生物。此外，還有蝸牛酶，主要用于花粉母細胞和四分體細胞。 za3～867纖維酶是上海植物生理研究所從野生型綠色木霉同各菌種中提取制成的，粗制品是多種酶的復(fù)合物，含有纖維素酶（包括c1、cx、b一葡萄糖苷酶等），果膠質(zhì)，半纖維素酶等，分離細胞壁的效果較好。這種復(fù)合酶使用時不需加半纖維素酶和果膠酶等，就可以分離出植物原生質(zhì)體。 日本產(chǎn)的onozuka纖維素酶常和果膠酶結(jié)合使用，可先用果膠酶降解果膠，使分開細胞，再用纖維素酶處理降解細胞壁。即二步法降解。

2．滲透穩(wěn)定劑

    植物細胞壁對細胞有良好的保護作用。去除細胞壁之后如果溶液中的滲透壓和細胞內(nèi)的滲透壓不同，原生質(zhì)體有可能漲破或收縮。因此在酶液、洗液和培養(yǎng)液中滲透壓應(yīng)大致和原生質(zhì)體內(nèi)的相同，或者比細胞內(nèi)滲透壓略大些。滲透壓大些有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定，但也有可能阻礙原生質(zhì)體的分裂。 因此，在分離原生質(zhì)體的酶溶液內(nèi)，需加入一定量的滲透穩(wěn)定劑，其作用是保持原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定，避免破裂。常用的兩種系統(tǒng)為：①糖溶液系統(tǒng)：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，濃度約在0．40～0．80mol／l。本系統(tǒng)還可促進分離的原生質(zhì)體再生細胞壁并繼續(xù)分裂；    ②鹽溶液系統(tǒng)：包括 kcl、mgso4和 kh2po4等。其優(yōu)點是獲得的原生質(zhì)體不受生理狀態(tài)的影響，因而材料不必在嚴格的控制條件下栽培，不受植株年齡的影響，使某些酶有較大的活性使原生質(zhì)體穩(wěn)定。另外，添加牛血清蛋白可減少或防止降解壁過程中對細胞器的破壞。近年來多采用在鹽溶液內(nèi)進行原生質(zhì)體分離，然后再用糖溶液作滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 此外，酶溶液里還可加入適量的葡聚糖硫酸鉀，它可提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。這種物質(zhì)可使rna酶不活化，并使離子穩(wěn)定。

3．酶溶液的ph值

    酶溶液的ph值對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和生活力影響很大。用菜豆葉片作培養(yǎng)材料時，發(fā)現(xiàn)原始ph值為5．0時，原生質(zhì)體產(chǎn)生一得很快，但損壞較嚴重，并且培養(yǎng)后大量破裂。當ph值提高到6．0時，Zui初原生質(zhì)體卻產(chǎn)生少，但與ph值為5．0時處理同樣時間后相比，原生質(zhì)體數(shù)量顯著增加。原始ph值提高到7．0時生活的原生質(zhì)體數(shù)量進一步增加，損傷的原生質(zhì)體也少得多。