GB/T標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了小鼠肺炎病毒（PVM）的血清學(xué)檢測方法，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和免疫酶試驗(yàn)（IEA），并明確了試劑要求、操作步驟和結(jié)果判定規(guī)則。 以下是具體內(nèi)容：

一、檢測方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：

原理：根據(jù)免疫學(xué)原理，采用PVM抗原檢測小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠血清中的PVM抗體。

操作步驟：包括包被抗原、封閉、加樣、孵育、洗滌、加酶標(biāo)二抗、顯色、終止反應(yīng)等步驟。

結(jié)果判定：用酶標(biāo)儀測定吸光值，根據(jù)吸光值判斷樣本是否為陽性。

免疫熒光試驗(yàn)（IFA）：

原理：采用PVM抗原檢測小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠血清中的PVM抗體?？乖贵w反應(yīng)后，加入熒光素標(biāo)記的二抗，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)來判斷是否感染。

操作步驟：包括抗原片準(zhǔn)備、加樣、孵育、洗滌、加熒光標(biāo)記二抗、洗滌、熒光顯微鏡下觀察等步驟。

結(jié)果判定：在熒光顯微鏡下以熒光的有無和強(qiáng)弱判定結(jié)果。

免疫酶試驗(yàn)（IEA）：

原理：與ELISA類似，也是基于抗原抗體反應(yīng)的特異性進(jìn)行檢測。

操作步驟：包括抗原準(zhǔn)備、加樣、孵育、洗滌、加酶標(biāo)抗體、顯色等步驟。

結(jié)果判定：通過觀察顏色反應(yīng)判斷樣本是否為陽性。

二、試劑要求

ELISA抗原：

特異性抗原：PVM感染小鼠待發(fā)病后取肺臟，研磨，制成10%懸液，離心后取上清液感染BHK21細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)+++時(shí)收獲。凍融處理后，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清液再經(jīng)超速離心濃縮后制成ELISA抗原。

正?？乖築HK21細(xì)胞凍融破碎后，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞碎片而獲得的上清液。

抗原片：PVM感染BHK21細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)++~+++時(shí)，將細(xì)胞用胰酶消化分散，PBS洗滌，涂片。室溫干燥后，冷固定10min，-20℃保存。

陽性血清：PVM免疫清潔或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠所獲得的抗血清。

陰性血清：清潔或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清。

酶結(jié)合物：辣根過氧化物酶標(biāo)記羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠IgG抗體，用于檢測相應(yīng)動(dòng)物血清抗體。辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌蛋白A（SPA）可用于小鼠、豚鼠、地鼠血清抗體的檢查。

熒光素標(biāo)記：異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠IgG抗體，用于檢測相應(yīng)動(dòng)物血清抗體。

三、操作步驟（以ELISA為例）

包被抗原：用特異性抗原或正?？乖幻笜?biāo)板，4℃過夜。

封閉：用封閉液封閉酶標(biāo)板，37℃孵育1小時(shí)。

加樣：加入待檢血清樣本，37℃孵育1.5小時(shí)。

洗滌：用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次。

加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育1小時(shí)。

洗滌：再次用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次。

顯色：加入底物液顯色，37℃孵育15分鐘。

終止反應(yīng)：加入終止液終止反應(yīng)。

測定吸光值：用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光值。

四、結(jié)果判定

試驗(yàn)有效性：陽性對(duì)照孔OD值平均值應(yīng)≥1.00，陰性對(duì)照孔OD值平均值應(yīng)≤0.15。若不滿足此條件，試驗(yàn)無效。

臨界值計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15。

結(jié)果判定：

若樣品OD值<臨界值，樣品為陰性。

若樣品OD值>臨界值，樣品為陽性。

復(fù)檢：對(duì)陽性檢測結(jié)果，應(yīng)選用同一種方法或另一種方法重試。如仍為陽性則判為陽性。