GB/T標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了狂犬病病毒（RV）的檢測(cè)方法，主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，以下是該標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的詳細(xì)介紹：

一、檢測(cè)原理

在微孔板上預(yù)包被純化狂犬病毒抗原，使免疫反應(yīng)在固相載體上進(jìn)行。當(dāng)被檢血清中有狂犬病病毒抗體存在時(shí)，則與孔壁上的抗原形成抗原-抗體復(fù)合物，再與抗犬IgG酶標(biāo)記物反應(yīng)，Zui后通過測(cè)定酶作用底物催化后的產(chǎn)物，進(jìn)行定性檢測(cè)。

二、主要試劑和器材

1. 試劑：

2. 犬狂犬病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒（定性），包括預(yù)包被狂犬病毒抗原的微孔板、狂犬病毒IgG酶標(biāo)記物、狂犬病毒IgG陽性對(duì)照、狂犬病毒IgG臨界對(duì)照、狂犬病毒IgG陰性對(duì)照、顯色液A、顯色液B、終止液、10倍濃縮洗滌液、樣品稀釋液等。

3. 器材：

4. 精密移液器（10μL～100μL）

5. 一次性移液器吸頭

6. 振蕩器

7. 酶標(biāo)儀（含450nm波長(zhǎng)濾光片）

8. 37℃恒溫培養(yǎng)箱

9. 吸水紙

三、檢測(cè)步驟

1. 樣品準(zhǔn)備：將采集到的待檢犬血液樣品離心，分離出待檢犬血清或血漿。應(yīng)避免使用染菌、溶血和高血脂的樣品；室溫保存樣品不應(yīng)超過8小時(shí)，若試驗(yàn)在8小時(shí)以后進(jìn)行，需將樣品保存在2℃～10℃，如保存超過一周，則應(yīng)保存在-20℃并避免反復(fù)凍融。

2. 試劑配置：將10倍濃縮洗滌液恢復(fù)至室溫，并振搖，然后用去離子水或蒸餾水作10倍稀釋。

3. 稀釋樣品：將已分離好的犬血清或血漿用樣品稀釋液做1:10稀釋，即取50μL血清或血漿加入到500μL樣品稀釋液中，并充分混勻。

4. 加樣：取所需量的預(yù)包被微孔板條固定于板架上，依次加入稀釋好的樣品，100μL/孔，然后將陽性、陰性對(duì)照各加1孔，臨界對(duì)照加3孔，100μL/孔，另留一孔不加樣品作為空白對(duì)照，在記錄紙上記錄各樣品和對(duì)照的次序或位置，剩余的板條放入密封袋中保存。

5. 孵育：加樣完成后，用封板膜蓋板條，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。

6. 洗板：甩凈孔中液體，拍干，用稀釋好的洗滌液加滿每孔，停留1分鐘后甩凈、拍干，如此重復(fù)洗滌3次。

7. 加酶：除空白對(duì)照外，其余各孔垂直滴加酶標(biāo)記物1滴（50μL），置37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30分鐘。

8. 顯色：重復(fù)步驟6洗板3次，拍干后每孔（含空白對(duì)照孔）垂直滴加顯色液A、B液各1滴，置37℃恒溫培養(yǎng)箱避光顯色10分鐘。

9. 終止：每孔（含空白對(duì)照孔）立即加入終止液1滴，混勻后以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定A值。

四、結(jié)果判定

1. 試驗(yàn)有效性判定：以空白孔調(diào)零，陰性對(duì)照值小于等于0.10，臨界對(duì)照A值應(yīng)在0.15～0.40之間，證明試驗(yàn)成立。

2. 樣品結(jié)果判定：

3. 待檢樣品A值大于等于臨界對(duì)照A值的平均值，判為陽性。

4. 待檢樣品A值小于臨界對(duì)照A值的平均值，判為陰性。

五、結(jié)果解釋

1. 基礎(chǔ)級(jí)犬：接種疫苗后，經(jīng)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到陽性值判為合格。

2. SPF級(jí)犬：不應(yīng)進(jìn)行疫苗接種，對(duì)陽性檢測(cè)結(jié)果，選用同一種方法或另一種方法重試。如為陽性則判為陽性。

3. 基礎(chǔ)級(jí)犬群體免疫抗體合格率：免疫抗體合格率=（被檢動(dòng)物抗體陽性數(shù)/被檢動(dòng)物總數(shù)）×?；A(chǔ)級(jí)犬群體免疫抗體合格率達(dá)到70%以上可判為該犬群免疫合格。