前言

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translationalmodifications,PTMs) 是指在翻譯后的蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈及其C/N末端引入新的基團(tuán)(如磷酸基、乙?；?。PTM在細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)降解、信號傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)互作過程中起著關(guān)鍵作用。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)是進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾鑒定的優(yōu)勢技術(shù)，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)修飾類型、修飾位點(diǎn)的鑒定以及修飾的相對定量。本文主要介紹基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾鑒定原理，并分析修飾鑒定和修飾組學(xué)產(chǎn)品的區(qū)別以及相關(guān)的技術(shù)難點(diǎn)。

修飾鑒定原理

蛋白質(zhì)的不同氨基酸位點(diǎn)可以在相關(guān)酶的作用下共價(jià)結(jié)合不同的官能基團(tuán)以實(shí)現(xiàn)多種類型的翻譯后修飾，常見的包括磷酸化(Phosphorylation)、乙?；?Acetylation)、泛素化(Ubi)、甲基化(Acetylation)等，因此修飾鑒定既需要確認(rèn)修飾的位點(diǎn)，又需要鑒別修飾基團(tuán)的種類。發(fā)生翻譯后修飾的蛋白質(zhì)在分子質(zhì)量上會(huì)發(fā)生相應(yīng)的增加，而每種官能基團(tuán)的分子質(zhì)量是已知的，通過檢測具體增加的分子質(zhì)量，就可以確定修飾的類型。質(zhì)譜技術(shù)能夠檢測到這種分子質(zhì)量的變化從而定性地鑒定修飾類型，還可以結(jié)合一級/二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)和相關(guān)理論數(shù)據(jù)庫以及生物信息學(xué)分析方法，確定修飾發(fā)生的氨基酸位點(diǎn)并進(jìn)行相對定量。

修飾鑒定的技術(shù)難點(diǎn)

難點(diǎn)一：非常見修飾的富集方法不成熟

在大部分生物系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)發(fā)生翻譯后修飾的比例都較低。以Zui常見的磷酸化修飾為例，雖然在人體表達(dá)的20000多種蛋白質(zhì)中，大部分都可能發(fā)生磷酸化修飾，但磷酸化修飾的比例往往不足1%。舉個(gè)例子，如果細(xì)胞中存在10000個(gè)A蛋白分子，其中可能只有100個(gè)甚至更少的蛋白分子A在特定位點(diǎn)發(fā)生了磷酸化修飾。

受限于目前檢測儀器的分辨率和靈敏度，為了降低無修飾蛋白和其他蛋白的干擾，充分檢測生物系統(tǒng)中的PTM，往往需要針對待檢測修飾類型的蛋白進(jìn)行富集和純化。目前研究較多的修飾類型，如磷酸化、乙?；⒎核鼗?，已經(jīng)有較為成熟的修飾富集方法。但一些研究較少或者本身在生物系統(tǒng)中較罕見、比例較低的PTM，其富集方法可能不太完善，富集效率也難以保證。

 難點(diǎn)二：修飾分子量偏差不確定或過大

如前文所說，基于質(zhì)譜的翻譯后修飾鑒定原理是識別修飾導(dǎo)致的分子量偏差，因此更適合于檢測分子量偏差固定且在質(zhì)譜常規(guī)檢測范圍內(nèi)的翻譯后修飾。如果某種翻譯后修飾造成的分子量偏差種類太多，或偏差過大超出質(zhì)譜檢測的分子量范圍，則往往需要結(jié)合其他方法進(jìn)行處理，通常是采用酶解或置換反應(yīng)，將原本難以檢測的修飾基團(tuán)轉(zhuǎn)換為更易于檢測的基團(tuán)。

例如糖基化修飾，根據(jù)糖鏈的結(jié)合方式和位置可分為N糖基化和O糖基化，并且不同的糖鏈糖型具有不同的分子量，因此難以直接鑒定；目前只有針對N糖基化的質(zhì)譜鑒定方法較為成熟，可以通過去糖基化酶處理切除糖鏈，識別糖鏈切除后的殘基帶來的分子量偏差來鑒定蛋白質(zhì)的糖基化修飾。又比如泛素化修飾和聚泛素化修飾，有多種泛素鏈結(jié)合方式、且修飾基團(tuán)分子量普遍偏大，通常是通過胰酶酶解，將泛素鏈切除，僅識別殘留的雙重甘氨酸殘基。因此，此類修飾通常僅能鑒定修飾所在的位置，而無法鑒定和區(qū)分修飾的具體糖鏈或聚泛素鏈類型。

修飾鑒定和修飾組學(xué)產(chǎn)品比較

目前本公司可以提供兩類翻譯后修飾相關(guān)的檢測分析服務(wù)。一類是目的蛋白的修飾鑒定，主要針對純化富集的特定蛋白進(jìn)行檢測分析，以鑒定修飾類型和修飾位點(diǎn)。

目的蛋白修飾鑒定的檢測樣本通常是分離純化后的蛋白膠條、beads或體外反應(yīng)溶液，要求樣品中蛋白組成較簡單、且待測靶標(biāo)蛋白含量較高。理論上在一次檢測中可分析所有可能的翻譯后修飾類型，但實(shí)際應(yīng)用中受限于分析算法和計(jì)算機(jī)的性能，建議單次分析中重點(diǎn)關(guān)注的修飾類型不超過3種。

另一類是定量修飾組學(xué)，主要針對特定的修飾類型進(jìn)行富集、檢測和分析，從而比較不同樣品中各個(gè)修飾位點(diǎn)的定量差異。

定量修飾組學(xué)通常以組織或細(xì)胞為待測樣品，需要根據(jù)待分析的修飾類型選擇不同的修飾富集方法，因此對樣品的起始蛋白含量要求較高，并且每次檢測只能夠分析選定的一種修飾類型。需要注意的是，由于定量修飾組學(xué)是對富集之后的肽段進(jìn)行修飾位點(diǎn)的相對定量，并不能確定修飾水平的變化是來源于修飾比例的變化還是蛋白整體水平的變化。因此在研究中，通常會(huì)結(jié)合常規(guī)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，根據(jù)蛋白本身的表達(dá)水平進(jìn)行修飾定量的校正。

總結(jié)

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾鑒定和定量分析是目前研究PTM重要的方法之一，質(zhì)譜檢測的二級譜圖可作為修飾位點(diǎn)鑒定的直接和有力的證據(jù)。受限于修飾發(fā)生比例和目前檢測儀器的性能，為了提高修飾鑒定和定量的效果，在分析前需要進(jìn)行純化富集。針對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化富集之后的目的蛋白修飾鑒定，適用于對目標(biāo)蛋白的修飾類型和位置進(jìn)行檢測分析；而定量修飾組學(xué)則更適用于對不同樣品中的特定修飾進(jìn)行相對定量比較，進(jìn)而找到修飾發(fā)生變化的靶標(biāo)蛋白、位點(diǎn)或信號通路。