01.產(chǎn)品介紹

本公司基于鄰近標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜推出PL-MS蛋白鄰近表達(dá)篩選解決方案，為客戶提供從細(xì)胞構(gòu)建培養(yǎng)、親和富集實(shí)驗(yàn)到質(zhì)譜高通量篩選的一站式服務(wù)（階段可選）。項(xiàng)目交付包括構(gòu)建細(xì)胞系（可選）和結(jié)題報(bào)告，報(bào)告內(nèi)容涵蓋高可信度候選互作蛋白清單、候選互作蛋白注釋富集分析、蛋白互作數(shù)據(jù)庫挖掘、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)篩選以及不同背景條件下互作蛋白結(jié)合強(qiáng)弱的動(dòng)態(tài)分析等。

02.技術(shù)原理

鄰近標(biāo)記（Proximity Labeling,PL）技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用（PPIs）、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等的常用工具。其原理是將標(biāo)記酶和目標(biāo)蛋白（Bait）融合表達(dá)，通過催化產(chǎn)生高度活潑反應(yīng)性小分子，原位標(biāo)記其周圍的鄰近分子。這些被標(biāo)記的分子隨后可通過親和純化和質(zhì)譜（MS）進(jìn)行篩選鑒定，從而繪制出目標(biāo)蛋白在天然細(xì)胞環(huán)境中的“分子鄰里地圖”。

03.標(biāo)記酶的選擇

不同鄰近標(biāo)記酶的特性決定了其適宜的研究場景，以下總結(jié)4種代表性標(biāo)記酶的選擇建議：

04.產(chǎn)品優(yōu)勢

05.項(xiàng)目方案

完整的鄰近標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)包括：①目標(biāo)序列獲取和質(zhì)?？寺?gòu)建、②基因編輯和細(xì)胞系構(gòu)建、③細(xì)胞培養(yǎng)和鄰近標(biāo)記、④生物素標(biāo)記蛋白的親和純化富集、⑤蛋白提取和酶解、⑥質(zhì)譜檢測和⑦數(shù)據(jù)分析和互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等步驟。為靈活匹配不同客戶需求，本產(chǎn)品提供以下4種服務(wù)方案：

方案一：微珠樣品服務(wù)方案（步驟⑤-⑦）

客戶提供親和富集實(shí)驗(yàn)獲得的磁性/瓊脂糖微珠樣品，我司完成MS-ready樣本制備、高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測分析、原始數(shù)據(jù)解析和臨近表達(dá)蛋白篩選分析。

送樣要求

1.親和富集后，用無去垢劑的緩沖液或PBS清洗后去上清，以微珠沉淀狀態(tài)保存和送樣。

2.至少1例實(shí)驗(yàn)組樣品和1例對(duì)照組樣品；建議每組3次重復(fù)。

3.建議每例樣品來源于至少5e6細(xì)胞（約1個(gè)10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿）蛋白的富集純化產(chǎn)物。

方案二：細(xì)胞樣品服務(wù)方案（步驟④-⑦）

客戶提供完成鄰近標(biāo)記的細(xì)胞樣品，我司完成親和富集實(shí)驗(yàn)、MS-ready樣本制備、高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測分析、原始數(shù)據(jù)解析和鄰近表達(dá)蛋白篩選分析。

送樣要求

1.收集細(xì)胞后，以PBS清洗3次，去上清，以細(xì)胞沉淀狀態(tài)保存和送樣。

2.至少1例實(shí)驗(yàn)組樣品和1例對(duì)照組樣品；建議每組3次重復(fù)。

3.建議每例樣品至少5e6細(xì)胞（約1個(gè)10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿）。

方案三：質(zhì)粒樣品服務(wù)方案（步驟②-⑦）

客戶提供包含目標(biāo)基因序列的質(zhì)粒樣品，我司完成目標(biāo)蛋白鄰近標(biāo)記標(biāo)簽過表達(dá)/原位表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)和鄰近標(biāo)記、親和富集實(shí)驗(yàn)、MS-ready樣本制備、高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測分析、原始數(shù)據(jù)解析和鄰近表達(dá)蛋白篩選分析。

送樣要求

1.注明準(zhǔn)確的NCBI基因名或Uniprot蛋白編號(hào)。

2.需提供20 μl以上質(zhì)粒，濃度大于100 ng/μl，質(zhì)粒溶于雙蒸水中。

3.建議提供目標(biāo)基因的核酸序列或目標(biāo)蛋白的氨基酸序列。

方案四：基因/蛋白名服務(wù)方案（步驟①-⑦）

客戶提供選定的基因名或蛋白名，我司完成目標(biāo)蛋白核酸序列的分離和克隆、目標(biāo)蛋白鄰近標(biāo)記標(biāo)簽過表達(dá)/原位表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)和鄰近標(biāo)記、親和富集實(shí)驗(yàn)、MS-ready樣本制備、高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測分析、原始數(shù)據(jù)解析和鄰近表達(dá)蛋白篩選分析。

送樣要求

1.注明準(zhǔn)確的NCBI基因名或Uniprot蛋白編號(hào)。

2.建議提供明確的細(xì)胞系和鄰近標(biāo)簽類型；如未指定，將由本公司按物種信息選擇默認(rèn)常規(guī)細(xì)胞系和鄰近標(biāo)簽。

3.建議提供目標(biāo)基因的核酸序列或目標(biāo)蛋白的氨基酸序列。

鄰近標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)流程圖

服務(wù)配置表

06.主要結(jié)果

基于定量數(shù)據(jù)的鄰近表達(dá)蛋白篩選

在蛋白定量列表中，誘餌蛋白親和富集樣品相比空白對(duì)照樣品蛋白定量差異上調(diào)4倍且P值顯著的蛋白被篩選為誘餌蛋白的候選鄰近表達(dá)蛋白。

互作蛋白篩選結(jié)果以火山圖展示，并對(duì)誘餌蛋白和相互作用top顯著的4個(gè)互作蛋白進(jìn)行標(biāo)注。橫坐標(biāo)表示蛋白在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間的定量差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)表示蛋白在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間差異P值。每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)蛋白，藍(lán)色點(diǎn)表示誘餌蛋白，紅色點(diǎn)表示篩選出的互作蛋白，灰色點(diǎn)表示非特異性背景蛋白。

基于此項(xiàng)分析，可選擇實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間差異倍數(shù)和P值排名都靠前的蛋白，進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證和功能探索。

互作蛋白功能注釋富集氣泡圖

對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行GO和KEGG注釋，并以鑒定到的所有蛋白列表作為背景，對(duì)篩選出的互作蛋白進(jìn)行富集分析。結(jié)果以氣泡圖展示，圖中每一行代表一個(gè)顯著富集的注釋條目，氣泡大小、顏色和橫坐標(biāo)分別表示該注釋條目的蛋白數(shù)量、富集P值及富集比值。

基于此項(xiàng)分析，可選擇富集P值排行前列或較為關(guān)注的注釋條目中的互作蛋白進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證和功能分析。

STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫信息挖掘

STRING數(shù)據(jù)庫是目前top全面、應(yīng)用top廣泛的蛋白互作數(shù)據(jù)庫。項(xiàng)目報(bào)告中會(huì)檢索STRING數(shù)據(jù)庫中誘餌蛋白的所有已知蛋白相互作用，并對(duì)其來源和文獻(xiàn)出處進(jìn)行標(biāo)注。

基于此項(xiàng)分析，可了解誘餌蛋白相關(guān)互作蛋白的研究現(xiàn)狀，作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的補(bǔ)充和參考。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)圖中心節(jié)點(diǎn)為誘餌蛋白，其他每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)互作蛋白，連線表示蛋白間存在相互作用。節(jié)點(diǎn)形狀用于展示蛋白互作信息的來源，即其為本次鄰近標(biāo)記實(shí)驗(yàn)鑒定到的，還是STRING數(shù)據(jù)庫中已收錄的，或者二者兼有；節(jié)點(diǎn)顏色用于展示實(shí)驗(yàn)樣品與對(duì)照樣品間蛋白的差異倍數(shù)。

關(guān)鍵結(jié)果子網(wǎng)路圖

基于Cytohubba重要性評(píng)分算法從蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中篩選出前20個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白并繪制子網(wǎng)絡(luò)，其中至少包含4個(gè)本次鄰近標(biāo)記實(shí)驗(yàn)鑒定到的互作蛋白，顏色表示該蛋白的重要性評(píng)分排序。本產(chǎn)品分別使用Degree、DMNC、MCC3種不同算法對(duì)蛋白在互作網(wǎng)絡(luò)中的重要性進(jìn)行評(píng)分。理論上，在互作網(wǎng)絡(luò)中重要性較高的蛋白更可能參與靶標(biāo)蛋白相關(guān)的生物功能或信號(hào)通路，并在其中發(fā)揮更重要的作用。

基于此項(xiàng)分析，可選擇重要性評(píng)分排名top的互作蛋白作為更可能具有重要功能的互作蛋白，進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證和功能分析。

注：此處僅展示一種算法網(wǎng)絡(luò)

蛋白互作動(dòng)態(tài)變化和聚類結(jié)果

蛋白之間的相互作用很多時(shí)候都是處于動(dòng)態(tài)變化的過程中，有些互作僅在特定條件下出現(xiàn)，而有些互作會(huì)隨條件變化而發(fā)生程度上的改變。若提供至少2個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，我們還會(huì)分析不同條件下蛋白相互作用程度的動(dòng)態(tài)變化。

基于誘餌蛋白和各個(gè)互作蛋白在對(duì)照組中的定量信號(hào)，對(duì)互作蛋白在實(shí)驗(yàn)組中的定量值進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算和評(píng)估不同條件下各個(gè)互作蛋白與誘餌蛋白的相互作用程度。在不同條件下誘餌蛋白及互作蛋白的互作程度差異，將分別以熱圖、折線圖和韋恩圖形式展示。

熱圖中色塊顏色表示互作蛋白在不同分組樣品中的定量數(shù)據(jù)，每一行表示一個(gè)互作蛋白。折線圖中每一條折線表示一個(gè)互作蛋白，橫坐標(biāo)表示不同的比較組，對(duì)應(yīng)不同條件下的蛋白相互作用；縱坐標(biāo)表示相互作用程度，各個(gè)互作蛋白與誘餌蛋白間top的互作程度校正為1，未發(fā)生互作時(shí)的互作程度校正為0，并且通過Mfuzz聚類分析，將所有互作蛋白根據(jù)其與誘餌蛋白互作程度的變化趨勢進(jìn)行分類，根據(jù)折線各個(gè)節(jié)點(diǎn)的縱坐標(biāo)變化，反映互作蛋白在不同條件下互作程度的變化。韋恩圖中每個(gè)圈表示一種分組條件下鑒定到的互作蛋白，重疊區(qū)域表示多種條件下均穩(wěn)定存在的蛋白相互作用。

基于此項(xiàng)分析，可選擇不同條件下互作程度變化top的蛋白，或具有特定變化趨勢的蛋白，進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證和功能分析。

總結(jié)

PL-MS鄰近標(biāo)記技術(shù)克服了傳統(tǒng)方法（如IP-MS，pulldown等）難以捕捉瞬時(shí)/微弱的相互作用的局限性。鏈霉親和素的高親和力、高兼容性可以捕獲更多傳統(tǒng)方法難以捕獲的膜蛋白和不溶性蛋白復(fù)合物。原位插入表達(dá)可以在接近生理狀態(tài)下解析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

PL-MS蛋白鄰近表達(dá)篩選解決方案，為客戶提供從細(xì)胞構(gòu)建培養(yǎng)、親和富集實(shí)驗(yàn)到質(zhì)譜高通量篩選的一站式服務(wù)。解決方案基于實(shí)驗(yàn)篩選保障陽性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)體系成熟數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高，服務(wù)整合程度高實(shí)驗(yàn)省心，數(shù)據(jù)結(jié)果豐富且可直接用于。報(bào)告涵蓋高可信度候選互作蛋白清單、候選互作蛋白注釋富集分析、蛋白互作數(shù)據(jù)庫挖掘、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)篩選以及不同背景條件下互作蛋白結(jié)合強(qiáng)弱的動(dòng)態(tài)分析等。

譜度眾合是一家由武漢大學(xué)博士團(tuán)隊(duì)創(chuàng)辦的科研服務(wù)企業(yè)，我們專注于利用質(zhì)譜技術(shù)服務(wù)于生物標(biāo)志物、藥物靶點(diǎn)篩選、基礎(chǔ)研究等蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域，我們?cè)诒緦I(yè)細(xì)分領(lǐng)域持續(xù)深耕十幾年，針對(duì)具體研究場景開發(fā)多種面向具體研究目的和需求的服務(wù)產(chǎn)品，助力于客戶更輕松更高效的完成科研目標(biāo)。