抗體純度、亞型、濃度檢測(cè)
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還原 SDS?PAGE:抗體重鏈~50kDa、輕鏈~25kDa,看雜帶多少,粗略評(píng)估純度。
非還原 SDS?PAGE:完整 IgG 約 150kDa,觀察完整抗體、降解片段、聚合體;只能定性 / 半定量。
局限:靈敏度有限,低含量雜質(zhì)看不出來。
金標(biāo)準(zhǔn),測(cè)單體、聚集體、降解片段占比
輸出:?jiǎn)误w %、高分子量聚集體 HMW%、低分子量降解 LMW%
適合:?jiǎn)慰箻悠?,可定量純度,工藝放行常用?/p>
自動(dòng)化,分辨率高于普通 SDS?PAGE,定量輕重鏈、雜質(zhì),生物醫(yī)藥藥典常用。
親和層析后 A280 只能測(cè)總蛋白,不能代表純度;
內(nèi)毒素、宿主蛋白 HCP 屬于雜質(zhì),但不屬于 “抗體分子純度”。
ELISA 亞型試劑盒:操作簡(jiǎn)單,適合雜交瘤上清、純化抗體,定性 + 半定量亞型。
流式 Bead 懸浮芯片(Luminex):可同時(shí)測(cè)多種亞型,適合多樣本批量。
質(zhì)譜 LC?MS:氨基酸序列水平確認(rèn)亞型,還可測(cè)翻譯后修飾,成本高。
注意:SDS?PAGE、SEC不能區(qū)分亞型,只能看分子量。
A280 紫外分光光度法IgG 摩爾消光系數(shù)一般取 1.35?1.45,快速測(cè)濃度;有其他蛋白雜質(zhì)時(shí)結(jié)果偏高。
BCA / Bradford 總蛋白:測(cè)總蛋白,若樣品只有抗體可用,有雜蛋白不準(zhǔn)。
ELISA 定量:特異性只測(cè)目標(biāo)抗體,不受雜蛋白干擾,適合細(xì)胞上清。
Octet/BLI 生物層干涉:實(shí)時(shí)檢測(cè),可同時(shí)測(cè)濃度 + 結(jié)合活性。
濃度:A280
純度:還原 + 非還原 SDS?PAGE
亞型:ELISA 亞型試劑盒
濃度:A280 + BCA 比對(duì)
純度:SEC?HPLC(單體 / 聚集體)+ CE?SDS
亞型:LC?MS 質(zhì)譜確證
可選:HCP 宿主殘留、蛋白 A 殘留檢測(cè)
樣品:純化抗體,盡量無甘油、高濃度咪唑;
緩沖液建議 PBS,pH7.2?7.4;
體積:≥100?200μL,濃度≥0.5?mg/mL;
避免反復(fù)凍融。
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