在細(xì)胞生物學(xué)的前沿領(lǐng)域，生物大分子相分離（PhaseSeparation）已成為解釋無膜細(xì)胞器形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等核心生命過程的關(guān)鍵機(jī)制。準(zhǔn)確篩選并鑒定具有相分離能力的蛋白質(zhì)（Phase-SeparatingProteins, PSPs），是深入研究其生物學(xué)功能及相關(guān)疾病機(jī)理的首要步驟。

為此，我們隆重推出B-isoxMS相分離蛋白篩選解決方案，為您的科學(xué)發(fā)現(xiàn)提供高效工具。

一、方案簡介

B-isox（生物素化異惡唑）在低溫條件下形成微晶體，能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)中富含內(nèi)在無序區(qū)（IntrinsicallyDisordered Regions,IDRs）的序列，并誘導(dǎo)這些蛋白質(zhì)發(fā)生聚集沉淀。結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)，該方案可實(shí)現(xiàn)高通量、無偏向性地鑒定具有相分離潛力的蛋白質(zhì)。

二、產(chǎn)品優(yōu)勢

● 高通量篩選

傳統(tǒng)的體外相分離實(shí)驗(yàn)（如濁度法、體外液滴觀察）通常僅適用于單一純化蛋白。而B-isoxMS能夠從復(fù)雜的生物樣本中一次性捕獲并鑒定整個(gè)“相分離潛力蛋白組”。

● 不依賴抗體或基因編輯

與免疫共沉淀（Co-IP）或鄰近標(biāo)記（BioID/APEX）不同，B-isox技術(shù)利用蛋白質(zhì)自身的生物物理特性（LCD共組裝）。因此，它無需特異性抗體，也無需對細(xì)胞進(jìn)行外源標(biāo)簽融合表達(dá)，可直接應(yīng)用于任意天然細(xì)胞系或臨床組織樣本。

● 相分離區(qū)域預(yù)測

通過IDR預(yù)測及catGRANULE模型，識(shí)別蛋白序列中潛在參與相分離的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)域，便于后續(xù)驗(yàn)證。

三、主要結(jié)果

a.相分離蛋白篩選

通過高分辨質(zhì)譜對經(jīng)B-isox沉淀富集的相分離特征蛋白進(jìn)行鑒定，進(jìn)而比較實(shí)驗(yàn)組與對照組之間差異變化的相分離蛋白（如刺激組vs對照組）。如下火山圖所示，藍(lán)色和紅色點(diǎn)分別代表顯著下調(diào)和上調(diào)的蛋白，通常為與刺激條件相關(guān)的候選相分離蛋白。以實(shí)測數(shù)據(jù)為例，顯著上調(diào)的Tmem97具有膜定位特征且包含內(nèi)在無序區(qū)，是公認(rèn)的相分離相關(guān)蛋白。

b.蛋白無序度打分

相分離過程依賴于π–π相互作用、陽離子–π相互作用及靜電作用等多價(jià)弱相互作用，這些相互作用通常富集于低復(fù)雜度序列（Low-ComplexityRegions, LCRs）及內(nèi)在無序區(qū)。因此，通過IDR預(yù)測可有效識(shí)別蛋白序列中潛在參與相分離的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)域。

下圖基于實(shí)測數(shù)據(jù)繪制了無序性分布圖。以RLP24_MOUSE蛋白為例，其全長163個(gè)氨基酸殘基中，自第25位至C端呈現(xiàn)連續(xù)且顯著的高無序評(píng)分區(qū)間。VSL2與VL3兩種預(yù)測模型結(jié)果一致，均指示該區(qū)域具有穩(wěn)定的無序特征。

c.相分離傾向評(píng)分：

基于FuzDrop機(jī)器學(xué)習(xí)模型，對候選蛋白每個(gè)氨基酸所處的局部環(huán)境進(jìn)行分析，預(yù)測其參與多價(jià)弱相互作用的潛力，并生成以氨基酸序列位置為橫軸、相分離能力為縱軸的傾向性得分圖譜。其中，得分大于0.6的區(qū)域?yàn)閺?qiáng)相分離驅(qū)動(dòng)區(qū)，是介導(dǎo)蛋白發(fā)生液-液相分離、形成液態(tài)凝聚體的關(guān)鍵功能區(qū)域。

采用catGRANULE模型對候選蛋白質(zhì)進(jìn)行相分離區(qū)域預(yù)測。該模型對每個(gè)氨基酸殘基的局部序列特征、上下文疏水性、電荷分布及內(nèi)在無序區(qū)屬性進(jìn)行解析，以0.5為判定閾值。得分高于該閾值的區(qū)域被判定為具備相分離能力的功能區(qū)段，是介導(dǎo)蛋白相分離、形成凝聚體的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

d.相分離數(shù)據(jù)庫比對：

將篩選獲得的候選列表與已知液–液相分離數(shù)據(jù)庫DrLLPS等進(jìn)行比對，利用外部參照體系對篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

e.功能富集分析

將B-isoxMS捕獲的高置信度相分離傾向蛋白，基于GO/KEGG/STRING等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物學(xué)功能注釋與富集、蛋白互作網(wǎng)路等分析。

f.蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

將B-isoxMS捕獲的高置信度相分離傾向蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并識(shí)別其中處于核心樞紐地位的靶標(biāo)（Hubs），這些靶標(biāo)通常是后續(xù)突變體驗(yàn)證或疾病機(jī)制研究的重點(diǎn)關(guān)注對象。

g.相分離蛋白候選清單

基于B-isoxMS定量倍數(shù)篩選、無序度預(yù)測、相分離傾向評(píng)分等多維數(shù)據(jù)整合，Zui終推薦Top10候選相分離潛力蛋白如下：

四、樣本準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)利用B-isox在生理?xiàng)l件下招募相分離傾向蛋白的物理特性，結(jié)合高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了高通量、高特異性、無偏見的相分離蛋白篩選。該實(shí)驗(yàn)無額外前置要求，提供細(xì)胞或組織樣本即可啟動(dòng)；項(xiàng)目周期為自啟動(dòng)日起13個(gè)工作日。

細(xì)胞樣品

（1）樣品為預(yù)冷PBS清洗之后的細(xì)胞沉淀，置于EP管中凍存和寄送。

（2）細(xì)胞數(shù)不少于1×107； 

（3）-20℃以下低溫凍存，干冰寄送。

動(dòng)物組織樣品

（1）樣品來源于單一部位組織，剪碎后以預(yù)冷生理鹽水或PBS清洗至清洗液中不見血色，用干凈濾紙吸干殘留液體后，置于EP管中凍存和寄送。

（2）組織重量不少于10mg。

（3）-20℃以下低溫凍存，干冰寄送。

總結(jié)

B-isoxMS相分離蛋白篩選解決方案基于高通量質(zhì)譜定量數(shù)據(jù)篩選，結(jié)合IDR無序區(qū)預(yù)測、FuzDrop、catGRANULE等相分離傾向性評(píng)分、功能注釋與富集分析、互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等，整合多維度數(shù)據(jù)，提供高可信度的候選清單。

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