GB15670-1995《農藥登記毒理學試驗方法》中14.6部分詳細規(guī)定了小鼠睪丸精母細胞染色體畸變試驗的方法與要求，該試驗旨在評估農藥對哺乳動物生殖細胞的遺傳毒性，通過檢測受試物引起小鼠睪丸精母細胞染色體畸變的效應，預測其遺傳危害和潛在致癌作用的可能性。

一、試驗原理

雄性生殖細胞從精原細胞發(fā)育成成熟精子需要經過多個發(fā)育階段，不同發(fā)育階段的雄性生殖細胞對化學物質的敏感性不同。初級精母細胞對化學誘變比較敏感，在哺乳動物精子發(fā)生過程中，DNA合成是在初級精母細胞細線期以前的各階段細胞中進行，以后發(fā)育的細胞不再進行DNA合成。因此，受試物需在前細線期給予，于小鼠第一次接觸受試物后的第12~14天采樣制片，可以觀察到前細線期接觸引起的精母細胞染色體畸變效應。

二、試驗動物與分組

動物選擇：選用6~8周齡健康雄性小鼠，每組應保證至少有5只存活小鼠。

分組設計：

陰性對照組：使用等體積的溶劑。

陽性對照組：使用已知具有誘變作用的物質，如絲裂霉素C（1.5~2mg/kg，腹腔注射一次）或環(huán)磷酰胺（40mg/kg，腹腔注射，每天1次，連續(xù)5天）。

受試物組：設3個劑量組，根據(jù)急性LD50，選用可使動物出現(xiàn)輕中毒癥狀、體重略有下降、不引起動物死亡的劑量為高劑量，按2~3倍組間間距設中、低劑量組。

三、試驗方法

受試物接觸方法：受試物接觸途徑應與實際接觸途徑一致或接近，可采取一次接觸或每天1次、連續(xù)5天的方法。

取樣時間：各組均于第一次接觸受試物后第12~14天將動物處死制片。

制片步驟：

動物處死前處理：處死前6小時腹腔注射秋水仙素（4mg/kg，0.04%秋水仙素按0.1ml/10g體重給予）。

睪丸取出與處理：以頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側睪丸，去凈周圍組織和脂肪，用低滲液洗去毛和血污后，放入盛有適量低滲液的小平皿中。

低滲處理：用眼科鑷撕開睪丸被膜，輕輕分離曲精管，加低滲液至8~10ml，室溫下低滲20~40分鐘（低滲時間視室溫條件而定）。

固定處理：仔細吸盡低滲液，加固定液10ml，固定20分鐘。必要時可存放在冰箱中過夜，但軟化前應將固定液吸掉，再加入新鮮配制的固定液，固定10分鐘。

軟化與離心：吸盡固定液，加60%冰醋酸1~2ml，待大部分曲細精管軟化后立即加入倍量的固定液，用吸管打勻，移入離心管，以1000r/min離心10分鐘。

制片：棄去大部分上清液，留下約0.5~1.0ml，充分打勻制成細胞混懸液。將細胞混懸液均勻地滴于冰水玻片上，每個樣本制片2~3張。

染色與觀察：用1:10Giemsa染液（pH6.8）染色20~40分鐘，立即用蒸餾水或pH6.8的磷酸緩沖液沖洗，晾干后放入片盒中保存。

四、觀察指標與結果判定

觀察指標：主要觀察染色體畸變類型，包括裂隙、斷片、微小體、相互易位、X-Y和常染色體的單價體等。

結果判定：

統(tǒng)計學分析：對每個動物記錄含染色體結構畸變的細胞數(shù)和每個細胞的染色體畸變數(shù)，按二項分布進行統(tǒng)計學分析。

陽性結果判定：劑量組染色體畸變率與陰性對照組相比有顯著性差異（P<0.05），且有明顯的劑量-反應關系，符合以上條件即可判定為染色體畸變陽性。染色體裂隙應分別記錄和報告，一般不計入畸變率。

五、質量控制與注意事項

質量控制要點：

受試物配制：應新鮮配制，固體受試物需溶解或懸浮于適當溶劑。

秋水仙素使用：宜當天新鮮配制，確保中期阻斷效果。

固定液配制：需新鮮配制，甲醇與冰乙酸比例為3:1。

低滲時間控制：精原細胞10分鐘，精母細胞20分鐘。

滴片操作：滴片時玻片需預冷，確保染色體分散良好。

染色時間調整：根據(jù)室溫調整染色時間，通常20分鐘左右。

鏡檢選擇：選擇背景清晰、分散良好、染色體收縮適中的中期分裂相進行觀察。

注意事項：

動物飼養(yǎng)環(huán)境：應符合GB 14925有關規(guī)定。

受試物給予量：一次給予的Zui大容量不應超過0.2ml/10g體重，如劑量較大，可在一天內分兩次給予。

陰性對照組處理：除不使用受試物外，其他處理與受試物組一致。

陽性對照組預期：應預期在精原細胞和精母細胞觀察到高于背景的染色體畸變增加。