1.染菌的檢查與判斷

  在發(fā)酵過程中對雜菌污染的及早發(fā)現，及時處理，是免除染菌造成嚴重損失的重要問題。因此，要求有確切、迅速的方法來檢出雜菌的污染，目前常用方法主要有以下幾種：

（1）顯微鏡檢查

    通常用革蘭氏染色法，染色后在高倍顯微鏡下觀察。對霉菌、酵母發(fā)酵，先用低倍顯微鏡觀察生產菌的特征，然后再用高倍顯微鏡觀察有否染菌存在，根據生產菌與雜菌的特征區(qū)別，判斷是否染菌。必要時，可進行芽孢和鞭毛染色。

（2）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法

   先將經滅菌的固體培養(yǎng)基倒入滅菌的平板中置培養(yǎng)箱攝氏37度，保溫24h檢查無菌即可使用。將需要檢查的樣品，在無菌平板上劃線，分別置攝氏37度、攝氏27度培養(yǎng)，以適應嗜中菌和低溫菌的生長，一般在8h后即可觀察。

   噬菌體檢查可采用雙層平板培養(yǎng)法，底層同為肉汁瓊脂培養(yǎng)基，上層減少瓊脂用量。先將滅菌的底層培養(yǎng)基熔后倒平板，凝固后，將上層培養(yǎng)基熔解并保持攝氏40度，加生產菌作為指示菌和待檢樣品混合后迅速倒在底層平板上，置培養(yǎng)箱保溫培養(yǎng)，經12~20h培養(yǎng)，觀察有無噬菌斑。

 培養(yǎng)基（ph7.0）

          葡萄糖（%）牛肉膏（%）蛋白胨（%）氯化鈉（%）瓊脂（%）

上層      0.5               1.0              1.0               0.5               1.0

下層      0.5               1.0              1.0               0.5               2.0

（3）肉湯培養(yǎng)檢查法

    將需要檢查樣品接入經滅菌并經過檢查無菌的肉湯培養(yǎng)基中，放置攝氏37度和攝氏27度分別培養(yǎng)24h，進行觀察，并取樣鏡檢。此法常用于檢查培養(yǎng)基和無菌空氣是否帶菌，也可用于噬菌體檢查，此時使用生產菌作為指示菌。

   葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，氯化鈉0.5%，蛋白胨0.8%，1%酚紅溶液0.4%，ph7.2。

    用以上的檢查方法檢查未發(fā)現污染，還不能肯定未被污染。

   除以上方法外，還可以從發(fā)酵過程的異?，F象來判斷是否染菌，如溶解氧、ph值、排氣中co2含量和菌體酶活力等變化來判斷。

2.發(fā)酵染菌率和染菌原因分析

（1）發(fā)酵染菌率

   發(fā)酵的總染菌率是指一年內發(fā)酵染菌的批數與總投料發(fā)酵批數之比。

   發(fā)酵染菌是在發(fā)酵罐中發(fā)生的染菌率，包括染菌后被挽救不了導致倒罐的批數，但種子罐培養(yǎng)的染菌不接入發(fā)酵罐，不導致發(fā)酵染菌的另行計算。

（2）染菌原因分析

    在發(fā)酵染菌之后，必須分析染菌原因，總結發(fā)酵染菌的經驗教訓，把發(fā)酵染菌消滅在發(fā)生之前，防患于未然，是積極制服發(fā)酵染菌的Zui重要措施。

    造成發(fā)酵染菌的原因很多，但總結歸納起來，其主要原因有：無菌空氣帶菌、設備滲漏、滅菌不徹底、操作失誤和技術管理不善。在發(fā)生染菌后，根據無菌試驗結果，參考以下方法進行分析，找出原因，杜絕污染。

（a）

   從染菌時間來看，發(fā)酵早期染菌，可能原因有：種子帶菌，培養(yǎng)基和設備滅菌不徹底，接種操作不當，無菌空氣帶菌；發(fā)酵后期染菌，可能原因有：中間補料污染，設備滲漏，操作問題。

（b）

   從污染的雜菌種類來看，污染耐熱的芽孢桿菌，可能是培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底；污染球菌、無芽孢桿菌等不耐熱雜菌可能是種子帶菌，設備滲漏；污染霉菌，一般是無菌室滅菌不徹底或操作問題。

（c）

  從染菌的幅度來看，如果各個發(fā)酵罐或多個發(fā)酵罐染菌，而且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問題；如果各別罐連續(xù)染菌，一般是設備問題。

   以上僅僅是在分析問題時作為考慮問題的入門，應根據具體情況綜合分析，且通過進一步的無菌檢查來驗證。

3.雜菌污染途徑及預防

（1）種子帶菌及防止

   種子帶菌的原因主要有以下幾方面

 （a）培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底 

     菌種培養(yǎng)基及用具滅菌均在滅菌鍋中進行，造成滅菌不徹底主要是滅菌時鍋內空氣排放不完全，造成假壓，使滅菌時溫度還達不到要求。

（b）菌種在移種過程中受污染

   菌種的移接工作是在無菌室中，按無菌操作進行。當菌種移接操作不當，或無菌室管理不嚴，就可能引起污染。因此，要嚴格無菌室管理制度和嚴格按無菌操作接種，合理設計無菌室。

（c）菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染

   菌種在培養(yǎng)過程和保藏過程中，由于外界空氣進入，也使雜菌進入而受污染。為了防止污染，試管的棉花塞應有一定的緊密度，不宜太松，且有一定長度，培養(yǎng)和保藏溫度不宜變化太大。每一級種子培養(yǎng)物均應經過嚴格檢查，確認未受污染才能使用。

（2）無菌空氣帶菌及防止

   無菌空氣帶菌是發(fā)酵染菌的主要原因之一。杜絕無菌空氣帶菌，必須從空氣凈化流程和設備的設計，過濾介質的選用和裝填，過濾介質的滅菌和管理等方面完善空氣凈化系統(tǒng)。

（3）培養(yǎng)基和設備滅菌不徹底導致染菌及防止

    培養(yǎng)基和設備滅菌不徹底的原因，主要與以下幾個方面有關

（a）原料形狀

  一般稀薄的培養(yǎng)基容易滅菌徹底，而淀粉質原料，特別是有顆粒時，容易由于滅菌不徹底，造成染菌。淀粉質培養(yǎng)基滅菌以采用實罐滅菌為好，在升溫時先攪拌混合均勻，并加一定量的淀粉酶邊加邊液化。

（b）實罐滅菌時未充分排除罐內空氣

   實罐滅菌時，罐內空氣未完全排除，造成“假壓”，使罐頂空間局部溫度達不到滅菌要求，導致滅菌不徹底而污染。為此，在實罐滅菌升溫時，應打開排氣閥門及有關聯(lián)接管的邊閥、壓力表接管邊閥，使蒸汽通過達到徹底滅菌。

（c）培養(yǎng)基連續(xù)滅菌時，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)基未達到滅菌溫度，導致滅菌不徹底而污染。培養(yǎng)基連續(xù)滅菌應嚴格控制滅菌溫度，采用自動控制裝置。

（d）設備、管道存在“死角”

   由于操作、設備結構、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達或不能充分到達預定應該到達的局部滅菌部位，從而不能到達徹底滅菌的要求。這些不能徹底滅菌的部位稱為“死角”，“死角”可以是設備、管道的某一部位，也可以是培養(yǎng)基或其他物料的某一部分。管道多指法蘭連接處等。

（4）設備滲漏引起染菌及防止

    發(fā)酵設備、管道、閥門的長期使用，由于腐蝕、摩擦和振動等原因，往往造成滲漏。例如：設備的表面或焊縫處有砂眼，由于腐蝕逐漸加深，Zui終導致穿孔；冷卻管受攪拌器作用，長期磨損，焊縫處受冷熱和振動產生裂縫而滲漏。為了避免設備、管道、閥門滲漏，應選用優(yōu)質的材料，并經常進行檢查。冷卻蛇管的微小滲漏不易被發(fā)現，可以壓入堿性水，在罐內可疑地方，用浸濕酚酞指示劑的白布擦，如有滲漏時白布顯紅色。

（5）操作問題

  上面已指出，在菌種培養(yǎng)過程中，如操作不當會引起染菌。在發(fā)酵過程如操作不當也引起染菌，如移種時或發(fā)酵過程罐內壓力跌零，使外界空氣進入而染菌；泡沫頂蓋而造成污染；壓縮空氣壓力突然下降，使發(fā)酵液倒流入空氣過濾器而造成污染；等等。防止操作失誤引起染菌，要加強對技術工人的技術培訓和責任教育，提高工人素質，加強管理措施。