免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。

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實(shí)驗(yàn)流程免疫熒光單標(biāo)記方法

免疫熒光單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子，方法比較簡(jiǎn)單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問(wèn)題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會(huì)直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。

1、所需材料與試劑

a.培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60%-70%的細(xì)胞。

b.一抗、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗。

c.4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預(yù)冷20 min)。

d.封閉液。

e.0.01mol/LPBS緩沖液。

2、染色方法

a.取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

b.加入0.3%的Tritonx-100, 37℃,30 rain

c.加入4%多聚甲醛試問(wèn)固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d.正常阻斷血清1:20封閉試問(wèn)20-30min，抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

e.去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃過(guò)夜?？贵w以0.01mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定)。

f. 0.3%TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 MPBS洗5 rain。

g.加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

h.0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用濾紙吸干。

i.90%甘油(PBS配制)封片。

j.激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。