GB 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)小鼠精原細(xì)胞或精母細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)》國標(biāo)檢測解析

一、標(biāo)準(zhǔn)基本信息

標(biāo)準(zhǔn)號：GB

中文名稱：食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 小鼠精原細(xì)胞或精母細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)

英文名稱：Chromosomal aberration test of mousespermatogonia or spermatocytes in national food safetystandards

發(fā)布日期：2014年12月24日

實(shí)施日期：2015年5月1日

發(fā)布單位：國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)（現(xiàn)國家衛(wèi)生健康委員會(huì)）

代替標(biāo)準(zhǔn)：GB 《小鼠睪丸染色體畸變試驗(yàn)》

二、標(biāo)準(zhǔn)適用范圍

GB標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了小鼠精原細(xì)胞或精母細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)的基本試驗(yàn)方法和技術(shù)要求，適用于評價(jià)受試物對小鼠生殖細(xì)胞染色體的損傷。根據(jù)具體情況，可以選擇精原細(xì)胞或精母細(xì)胞作為靶細(xì)胞。

三、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容詳解

術(shù)語和定義：

精原細(xì)胞：雄性哺乳動(dòng)物曲細(xì)精管上皮中能經(jīng)過多次有絲分裂增殖并經(jīng)減數(shù)分裂產(chǎn)生精母細(xì)胞的干細(xì)胞，為原始的雄性生殖細(xì)胞，具有體細(xì)胞相同的染色體數(shù)目。

精母細(xì)胞：由精原細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂產(chǎn)生的能Zui終分化成成熟精子的細(xì)胞，分為初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞。次級精母細(xì)胞染色體數(shù)減半成1n。

染色體結(jié)構(gòu)畸變：在細(xì)胞有絲分裂中期通過顯微鏡可以直接觀察到的染色體結(jié)構(gòu)變化，包括斷裂、斷片、環(huán)狀染色體等。

染色體數(shù)目畸變：染色體數(shù)目發(fā)生改變，不同于正常二倍體核型，包括整倍體和非整倍體。

試驗(yàn)原理：

通過觀察受試物對小鼠精原細(xì)胞或精母細(xì)胞染色體畸變的影響，評估受試物對雄性生殖細(xì)胞的致突變性。

試驗(yàn)采用經(jīng)口灌胃方式給予受試物，通過細(xì)胞分裂中期阻斷劑處理，制備染色體標(biāo)本進(jìn)行顯微鏡觀察分析。

儀器設(shè)備與試劑：

儀器設(shè)備：包括解剖器械、電子天平、冰箱、離心機(jī)等通用實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，以及顯微鏡（用于觀察中期分裂相細(xì)胞及染色體結(jié)構(gòu)）。

試劑：包括0.1%秋水仙素、1%檸檬酸三鈉、60%冰乙酸、固定液（甲醇:冰乙酸=3:1）、磷酸鹽緩沖液（pH7.4）、Giemsa染液等。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備：

選擇健康成年雄性小鼠，周齡7~12周，試驗(yàn)開始時(shí)體重差異不超過平均體重的±20%。

每組至少包括5只可用于分析的動(dòng)物。試驗(yàn)前進(jìn)行3~5天環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀察。

飼養(yǎng)條件符合GB 14925，飲用水符合GB 5749，飼料符合GB 14924相關(guān)規(guī)定。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：

陰性對照：除不使用受試樣品外，其他處理與受試物組一致。

陽性對照：環(huán)磷酰胺（40mg/kg）或絲裂霉素C（1.5~2mg/kg）。

受試物組：高劑量組原則上為動(dòng)物出現(xiàn)中毒表現(xiàn)和/或個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)死亡的劑量，一般取急性經(jīng)口毒性LD50的50%作為高劑量，按等比級數(shù)2~4向下設(shè)置中、低劑量。

劑量分組：包括陰性對照、陽性對照和受試物組（3個(gè)劑量組）。

試驗(yàn)操作流程：

頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側(cè)睪丸，去凈脂肪，于低滲液中洗去毛和血污。

根據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行低滲處理、固定、離心、滴片等步驟制備染色體標(biāo)本。

用1:10 Giemsa應(yīng)用液染色10分鐘，蒸餾水沖洗、晾干。

精原細(xì)胞：一般一次給予，Zui大容量20mL/kg。高劑量組于末次給藥后24h和48h采樣，中低劑量組于末次給藥后24h采樣。

精母細(xì)胞：每天一次，連續(xù)5天。第一次給藥后12~14天采樣。

受試物給予：

秋水仙素處理：動(dòng)物處死前3~5小時(shí)腹腔注射秋水仙素4~6mg/kg體重，注射體積10~20mL/kg體重，宜當(dāng)天現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)本制備：

觀察指標(biāo)與結(jié)果分析：

記錄每個(gè)動(dòng)物含染色體結(jié)構(gòu)畸變的細(xì)胞數(shù)和每個(gè)細(xì)胞的染色體畸變數(shù)，按二項(xiàng)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

受試劑量組染色體畸變率或畸變細(xì)胞率與陰性對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，結(jié)果可定為陽性。

精原細(xì)胞：斷裂、斷片、微小體、無著絲點(diǎn)環(huán)、環(huán)狀染色體、雙或多著絲點(diǎn)染色體、單體互換等。

精母細(xì)胞：裂隙、斷片、微小體、相互易位、XY和常染色體的單價(jià)體等。

觀察指標(biāo)：

結(jié)果分析：

質(zhì)量控制要點(diǎn)：

高劑量組精原細(xì)胞有絲分裂指數(shù)應(yīng)不低于對照組的50%。

陽性對照組應(yīng)觀察到高于背景的染色體畸變增加。

所有試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，確保試劑質(zhì)量。

嚴(yán)格按照時(shí)間要求進(jìn)行操作。

玻片編號清晰，避免混淆。

安全注意事項(xiàng)：

秋水仙素為有毒物質(zhì)，操作時(shí)注意防護(hù)。

陽性對照物環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C為致癌物，嚴(yán)格管理。