一、檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA 方法，樣品中游離的黃
曲霉毒素M1 與酶標板上固相包被的黃曲霉毒素M1 抗原
競爭結合特異性抗體，酶標二抗可與抗體反應，再通過酶
的專一性顯色劑顯色，因為酶可以使無色的顯色劑轉變成
藍色，終止液的加入可以終止顯色，藍色轉變成黃色，吸
收值可以在450nm 處進行測定。顏色變化的程度反映樣品
中黃曲霉毒素M1 的含量。
二、檢測范圍
本試劑盒是應用ELISA 技術研發(fā)的藥物殘留檢測產品,
與儀器分析技術比較，能經濟、快速地檢測出液態(tài)奶、奶
粉、酸奶、奶酪等樣本中的黃曲霉毒素M1。
三、交叉反應率
黃曲霉毒素M1…………………………………
四、試劑盒組成
酶標板1 塊，96 孔/板
標準液6 瓶（1ml/瓶）：
0 ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45 ppb、1.35 ppb、4.05 ppb
抗體工作液……………………………………………5mL
酶標記物……………………………………………10mL
底物液A ……………………………………………7mL
底物液B ……………………………………………7mL
終止液…………………… ..……… ………… .. .…7mL
10× 濃縮酸奶樣品稀釋液………………………5mL
10× 濃縮洗滌液………………….…...…………40mL
2× 濃縮樣品稀釋液………………. ..…………50mL
說明書…… … … … … … … . . … … … . .… … … 1 份
五、使用單位需自備的設備及試劑
（1）儀器
微孔板酶標儀(450 nm/630 nm)
振蕩器；離心機；渦旋儀；
電子天平（感量0.01 g）
（2）器材
單道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL
多道微量移液器：30 μL～300 μL
（3）試劑
去離子水
五、溶液的配制
配液1: 樣品稀釋液
用去離子水將濃縮樣品稀釋液按1：1 體積比進行稀釋，
即1 份濃縮樣品稀釋液加1 份去離子水。
配液2: 洗滌工作液
用去離子水將濃縮洗滌液按1：9 體積比進行稀釋，即
1 份濃縮洗滌液加9 份去離子水，用于酶標板的洗滌，
洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。
配液3: 酸奶樣品稀釋液：將濃縮酸奶樣品稀釋液用去離子
水按1:9 體積比進行稀釋（1 份濃縮酸奶樣品稀釋液
+9 份去離子水）。
配液4：樣品提取液：將甲醇和濃縮樣品稀釋液按1:3 體積
比例進行混勻（1 份甲醇+3 份濃縮樣品稀釋液）。
六、樣本前處理方法
樣本處理前須知：
（1）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要
更換吸頭。
（2）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔
凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結果。
樣本前處理步驟：
（一）液態(tài)奶（含生鮮奶及成品液態(tài)奶）
1、取待測樣品，3000rmp 室溫下離心10min（除去脂肪層）；
2、下層500μL 待測樣本，加入500μL 樣品稀釋液混勻2min；
3、取下層50μL 用于分析。
稀釋倍數(shù)：2
（二）酸奶
1、稱取0.5g 待測樣品，加入500μL 酸奶樣品稀釋液，混
勻2min；
2、7000rmp 室溫下離心10min
3、取下層50 μL 用于分析。
稀釋倍數(shù)：2
（三）奶粉
1、稱取1 g 樣品，加入6mL 乙腈，混勻2min；
2、3000rpm 室溫下離心，10min；取上清3ml，50℃氮吹；
3、加入0.5ml 濃縮樣品稀釋液復溶，再加入0.5ml 正己烷
混勻2min，3000rpm 室溫下離心，5min；
4、取下層50μL 用于分析。
稀釋倍數(shù)：1
（二）奶酪
1、取1g 研磨后的奶酪，加入6ml 甲醇，7000rpm 室溫下
離心，5min；
2、取下層2ml，60℃氮吹；
3、加入1ml 石油醚，再加入2ml 樣品提取液，混勻2min；
4、5000rpm 室溫下離心，5min；
5、取下層50 μL 用于分析。
稀釋倍數(shù)：6
七、酶聯(lián)免疫檢測步驟
測定前須知：
1、使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫。
2、使用之后立即將所有試劑放回2~8 ℃。
3、在使用中不要讓微孔干燥。
4、在ELISA 分析中的重復性，很大程度上取決于洗板的一
致性，正確的洗板操作是ELISA 測定程序中的要點。
5、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住
微孔板。
測定步驟：
1、將所需試劑和微孔板從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡
30 min，每種液體使用前均須搖勻。注意標準液均需做2
個平行試驗。
2、加標準品：加入標準品/樣品50 μL/孔，再加抗體工作液
50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋好，室溫25 ℃下
避光反應15 min。
3、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加洗滌液300
μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗滌4~5 次，用吸水紙
拍干。
4、加結合物：加入酶標記物100 ??L/孔，輕輕振蕩混勻，用
蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應15min，取出重復
洗板步驟3。
5、顯色：每孔先各加入底物液A 50 μL，再各加入底物液B
50 μL，輕輕振蕩混勻，并在室溫25℃下避光反應10~15
min。
6、測定：每孔各加50 μL 終止液，設定酶標儀在450 nm 處，
測定OD 值（建議用450/630 nm 雙波長檢測，在5 min
內讀完數(shù)據(jù)）。
八、結果分析
所測得的標準液或樣品吸光度的平均值（B）除以
第一個標準液（0 標準液）的吸光度（B0）值再乘以，
得到百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝
B
B
0
??
以標準品濃度的10 為底的對數(shù)為X 軸， 百分吸光
值為Y 軸，繪制標準曲線。將樣本的百分吸光值代入標
準曲線，從標準曲線上讀出樣本所對應的值，作為10 的
冪，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中所含黃曲霉毒素M1 的量。
利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品
的準確、快速分析。
九、試劑盒靈敏度、準確度、精密度
靈敏度：0.05 ppb
檢測限：
液態(tài)奶…………………………………0.1ppb
酸奶……………………………………0.1pb
奶粉…………………………………0.25ppb
奶酪…………………………………0.3pb
回收率：80±15%
精密度：試劑盒的變異系數(shù)均小于10%
十、注意事項
1、室溫低于20 ℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20~
25 ℃）會導致所有標準的OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標
準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象，所以洗板拍干
后應立即進行下一步操作。
3、反應終止液為2M 硫酸，避免接觸皮膚；若不慎滴漏
到皮膚上，請盡快用水沖洗。
4、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有
效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的
試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號
試劑盒中的試劑。
5、保存試劑盒于2~8 ℃，不要冷凍，將不用的微孔板放
進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏
感，因此要避免直接暴露在光線下。
6、顯色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質，應當棄之；0
標準的吸光度（450 nm）值小于0.5（A450nm< 0.5）時，
表示試劑可能變質。
7、在加入底物液后，一般顯色15 min 即可。若顏色較
淺，可延長反應時間到20 min（或更長），但不得超
過30 min；反之，則減短反應時間。
8、該試劑盒反應溫度為25 ℃是特好的，溫度過高或過低將
導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
十一、貯藏條件及保存期
貯藏條件：在2~8 ℃保存試劑盒。
保存期：本試劑盒有效期為12 個月。