飛凡檢測(cè)細(xì)胞周期的四種檢測(cè)方法詳解；

細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。細(xì)胞周期是一個(gè)重要的檢測(cè)參數(shù)，研究細(xì)胞周期變化的影響對(duì)于腫瘤的發(fā)展及藥物研發(fā)有著重要的作用。例如，已知抑制有絲分裂的化合物大都用來(lái)減緩腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

細(xì)胞周期內(nèi)有兩個(gè)階段Zui為重要：G1 到 S 和 G2 到M；這兩個(gè)階段正處在復(fù)雜活躍的分子水平變化的時(shí)期，容易受環(huán)境條件的影響，如果能夠人為地進(jìn)行調(diào)控，將對(duì)深入了解生物的生長(zhǎng)發(fā)育和控制腫瘤生長(zhǎng)等有重要意義。能夠方便有效地檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，對(duì)于藥物研發(fā)和疾病研究等都具有重要的意義。

單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。

那么，細(xì)胞周期的測(cè)定如何進(jìn)行的呢？測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、流式細(xì)胞儀法、基于細(xì)胞成像的熒光檢測(cè)法等。

一、同位素標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞周期-飛凡檢測(cè)

標(biāo)記有絲分裂百分率法 (PLM)是一種常用的測(cè)定細(xì)胞周期時(shí)間的方法。其原理是對(duì)測(cè)定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期。

測(cè)定原理：

① 待測(cè)細(xì)胞經(jīng) 3H- 胸腺嘧啶核苷標(biāo)記后，所有 S 期細(xì)胞均被標(biāo)記。

② S 期細(xì)胞經(jīng) G2 期才進(jìn)入 M 期，所以一段時(shí)間內(nèi) PLM = 0。

③ 開始出現(xiàn)標(biāo)記 M 期細(xì)胞時(shí)，表示處于 S 期Zui后階段的細(xì)胞，已渡過(guò) G2 期，所以從 PLM = 0 到出現(xiàn) PLM 的時(shí)間間隔為G2期的持續(xù)時(shí)間。

④ S 期細(xì)胞逐漸進(jìn)入 M 期，PLM 上升，到達(dá)到Zui高點(diǎn)的時(shí)候說(shuō)明來(lái)自處于 S Zui后階段的細(xì)胞，已完成 M，進(jìn)入 G1期。所以從開始出現(xiàn) M 到 PLM 達(dá)到Zui高點(diǎn) (≈ ) 的時(shí)間間隔就是 M 期的持續(xù)時(shí)間。

⑤ 當(dāng) PLM 開始下降時(shí)，表明處于 S 期Zui初階段的細(xì)胞也已進(jìn)入 M 期，所以出現(xiàn) LM 到 PLM 又開始下降的一段時(shí)間等于 S期的持續(xù)時(shí)間。

二、流式細(xì)胞儀PI 染色法-飛凡檢測(cè)

細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA合成后期 ( G2 期 )。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能 ( G0 期 )。

檢測(cè)細(xì)胞周期的原理：

由于細(xì)胞周期各時(shí)相的 DNA 含量不同，通常正常細(xì)胞的 G1 / G0 期具有二倍體細(xì)胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 /M 期具有四倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi) DNA含量。因此，通過(guò)流式細(xì)胞儀 PI 染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi) DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為 G1 / G0 期，S 期和 G2 /M期，獲得的流式直方圖對(duì)應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的細(xì)胞百分率。

三、基于成像的熒光檢測(cè)法-飛凡檢測(cè)

FUCCI (fluorescent ubi cell-cycle indicator)小球能鑒別細(xì)胞處在細(xì)胞周期的哪一時(shí)期，因此可以用來(lái)研究癌癥細(xì)胞周期的進(jìn)程。FUCCI 技術(shù)建立在鑒定過(guò)表達(dá)的兩種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是綠色熒光基團(tuán) AmCyan，而 Cdt1 融合的是紅色熒光基團(tuán)mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平隨著細(xì)胞周期的變化而不斷波動(dòng)：Cdt1 蛋白水平在 G1 階段達(dá)到峰值，而geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不斷升高。這一結(jié)果體現(xiàn)為表達(dá) FUCCI 細(xì)胞核在G1 期為紅色而在 S，G2 和 M期則呈現(xiàn)綠色 ( 圖 2 )。

1檢測(cè)方法-飛凡檢測(cè)

A375S FUCCI 球體準(zhǔn)備的方法如下：Corning 公司 96 孔 U 型底低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含有 EGF (20 ng/ mL) 和 B27 (1×)的 DMEM / F 12 培養(yǎng)基，按每孔 1,000 細(xì)胞進(jìn)行種板。細(xì)胞板離心 (800 g,6min) 后在 37 ℃，5% CO2條件下進(jìn)行孵育。Zui后，用含 10% FCS 的培養(yǎng)基清洗球體 3 次以移除 EGF 和B27，繼續(xù)培養(yǎng) 1 至 6 天。

2數(shù)據(jù)分析-飛凡檢測(cè)

MiniMax 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的透射光模塊可以從自動(dòng)聚焦得到更好的圖像效果。SoftMax Pro 軟件中的“FieldAnalysis”能進(jìn)行自定義分析從而鑒別細(xì)胞重疊的部分。我們應(yīng)用一種特殊的鑒別方法來(lái)區(qū)分目標(biāo)球體和其余物體，如殘?jiān)蛡€(gè)體細(xì)胞，從而在后續(xù)的分析中予以去除(Figure 2, A andE)。Zui后，我們選擇感興趣的區(qū)域并從圖像中去除不想要的物體。在綠色和紅色熒光通道中，球體可以通過(guò)“ObjectCount”模式中大小和與背景相對(duì)熒光強(qiáng)度的區(qū)別被輕易的篩選出來(lái) (Figure 2, B-D, F-G)。然后運(yùn)用SoftMaxPro 軟件計(jì)算圖像的“% Area coverage”和球體的“Object Area” (μm2)。圖像的獲取和分析的設(shè)置方法見表1。

3結(jié)果-飛凡檢測(cè)

SoftMax Pro 軟件中獲取及分析的設(shè)置可以在綠色和紅色熒光通道的透射光下簡(jiǎn)便快速地分辨每個(gè)孔中的單球體。SoftMaxPro軟件還可計(jì)算所有通道包含的面積占比和物體面積 (μm2) (圖 3，表2)。在綠色和紅色熒光通道下可以獲得zuihao的結(jié)果。對(duì)于 FUCCI 球體來(lái)說(shuō)，圖 3中紅色部分展示的是光滑圓潤(rùn)的球體而綠色部分則在細(xì)胞表面，說(shuō)明球體內(nèi)部的細(xì)胞處在 G1 期而表面細(xì)胞即將進(jìn)入 M期。對(duì)應(yīng)軟件可以分辨球體大小和形狀 ( 球形參數(shù) ) 的各種變化，因此常用來(lái)研究多種處理，如抗癌藥物，對(duì)細(xì)胞增殖的影響 ( 圖4)。MiniMax 中綠色和紅色熒光的光學(xué)成形功能可以將 3D 圖像轉(zhuǎn)換為 2D 投射球體圖。