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WS/T 775—2021新型冠狀病毒消毒效果實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
 

1 范圍

本文件規(guī)定了消毒因子對(duì)新型冠狀病毒消毒效果實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)的基本要求、病毒滅活試驗(yàn)方法、結(jié)果

評(píng)價(jià)和注意事項(xiàng)。

本文件適用于新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室消毒效果的檢測(cè)與評(píng)價(jià)。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

消毒技術(shù)規(guī)范（2002年版）衛(wèi)生部 (衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕282號(hào))

3 術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

低溫消毒cryogenic disinfection

對(duì)溫度在0℃以下的環(huán)境或物品進(jìn)行的消毒。低溫消毒需使用在該溫度下被證明有效的消毒因子。

4 基本要求

4.1 實(shí)驗(yàn)室及人員要求

新型冠狀病毒消毒效果試驗(yàn)應(yīng)在獲得開(kāi)展新型冠狀病毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)資格的BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行；

從事新型冠狀病毒消毒效果評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)同時(shí)具有病毒學(xué)和消毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)；進(jìn)入BSL-3

實(shí)驗(yàn)室的人員應(yīng)經(jīng)過(guò)生物安全的培訓(xùn)和考核，具有BSL-3實(shí)驗(yàn)室的準(zhǔn)入資格。

4.2 試驗(yàn)要求

4.2.1 實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)分懸液法病毒滅活試驗(yàn)和載體法病毒滅活試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)以懸液法病毒滅活試驗(yàn)

為主，對(duì)不適宜用懸液法病毒滅活試驗(yàn)評(píng)價(jià)的消毒劑和器械，如黏稠的消毒劑、原液使用的消毒劑及紫

外線等消毒器械的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)可用載體法病毒滅活試驗(yàn)。

 4.2.2實(shí)驗(yàn)室懸液病毒滅活試驗(yàn)時(shí)，有機(jī)干擾物為牛血清白蛋白。原則上對(duì)用于不經(jīng)過(guò)清洗或污染的

消毒對(duì)象的消毒劑，牛血清白蛋白的濃度為3.0%；對(duì)用于經(jīng)過(guò)清洗或較清潔的消毒對(duì)象的消毒劑，牛

血清白蛋白的濃度為 0.3%；對(duì)用于經(jīng)過(guò)嚴(yán)格清洗或極清潔的消毒對(duì)象的消毒劑，可不使用有機(jī)干擾物。

試驗(yàn)中病毒接觸的溶液、病毒載體等，均應(yīng)在試驗(yàn)溫度（20℃±1 ℃）平衡后開(kāi)始試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室載體

病毒滅活試驗(yàn)時(shí)使用相應(yīng)滴度的病毒培養(yǎng)液滴染載體后備用。

4.2.3 用于評(píng)估消毒因子低溫消毒效果時(shí)，應(yīng)做規(guī)定低溫條件下的消毒效果驗(yàn)證，一般采用載體法進(jìn)

行。試驗(yàn)時(shí)消毒劑和病毒載體應(yīng)在低溫環(huán)境下平衡不少于30 min 后進(jìn)行測(cè)試，其余實(shí)驗(yàn)步驟與常溫下

（20 ℃±1 ℃）相同。

 4.2.4試驗(yàn)重復(fù) 3 次，重復(fù)性試驗(yàn)應(yīng)分期分批進(jìn)行。必要的器材和試劑應(yīng)重新制備或，以防產(chǎn)生

系統(tǒng)性誤差。

5 病毒滅活試驗(yàn)方法

5.1 試驗(yàn)器材

5.1.1 試驗(yàn)病毒與細(xì)胞

試驗(yàn)病毒為分裝保存并確定病毒滴度的新型冠狀病毒培養(yǎng)物，細(xì)胞株為非洲綠猴腎傳代細(xì)胞（Vero-

E6）或其它適合用于新型冠狀病毒增殖培養(yǎng)的細(xì)胞系。

5.1.2 有機(jī)干擾物

牛血清白蛋白。

5.1.3 試劑

消毒因子、中和劑、細(xì)胞消化液、細(xì)胞維持液和細(xì)胞培養(yǎng)液等。

5.1.4 儀器

化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱、水浴箱、II級(jí)或 II 級(jí)以上生物安全柜等。

5.1.5 耗材

無(wú)菌帶濾芯tip頭、吸管、離心管、凍存管、試管、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板、單道移液器、多道移液器等。

5.1.6 載體

可選用布片、玻璃片、不銹鋼片等。

5.2 細(xì)胞準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)所用Vero- E6細(xì)胞或其它細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)傳代培養(yǎng)，置化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，

5%±1% 化碳）中培養(yǎng)至單層細(xì)胞備用。

5.3 病毒懸液的制備

取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與設(shè)定濃度的有機(jī)干擾物混合作為消毒劑滅活

試驗(yàn)用病毒懸液。

5.4 載體的制備

5.4.1 載體應(yīng)根據(jù)消毒對(duì)象選擇相應(yīng)的材料。常用的材料有布片、玻璃片、不銹鋼片等，金屬載體一

般用 12 mm 直徑圓形金屬片（厚 0.5 mm），其他材質(zhì)載體一般為方形，大小 10 mm×10 mm，特定用途

的消毒因子可使用其他相兼容材質(zhì)的載體。

5.4.2 所用載體于染病毒前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。脫脂過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照如下步驟進(jìn)行：

a) 將載體放入含洗滌劑的水中煮沸 30min;

b) 用自來(lái)水漂洗；

c) 用蒸餾水煮沸 10min；

d) 用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性；

e) 晾干，備用。

5.4.3載體經(jīng)壓力蒸汽后烘干備用，試驗(yàn)前使用滴染法染病毒懸液。

5.4.4滴染載體的病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥4.0。

5.5 中和劑鑒定試驗(yàn)

5.5.1 設(shè)計(jì)原則

鑒定試驗(yàn)旨在確定所選中和劑是否適用于擬進(jìn)行的細(xì)胞感染法病毒滅活試驗(yàn)。中和劑鑒定試驗(yàn)包括

預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定消毒劑、中和產(chǎn)物和中和劑等對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有無(wú)影響；通過(guò)所設(shè)各組

試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，確定所用中和劑是否對(duì)測(cè)試消毒劑有良好的中和作用，對(duì)試驗(yàn)用病毒和細(xì)胞株是否

有害或不良影響；中和試驗(yàn)用消毒劑濃度應(yīng)為正式消毒試驗(yàn)濃度，作用時(shí)間*短不得少于30s。試

驗(yàn)重復(fù)3次。

5.5.2 試驗(yàn)分組

5.5.2.1 預(yù)試驗(yàn)分組

在使用細(xì)胞感染法進(jìn)行病毒滅活試驗(yàn)時(shí)，對(duì)所用中和劑的鑒定，應(yīng)進(jìn)行以下各組預(yù)試驗(yàn)，如果中和

劑與中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響，再進(jìn)行正式試驗(yàn)。

a) 中和劑+細(xì)胞→培養(yǎng)：觀察所用中和劑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有無(wú)影響。

b) （消毒劑+中和劑）+細(xì)胞→培養(yǎng)：觀察中和產(chǎn)物溶液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有無(wú)影響。

c) 消毒劑+細(xì)胞→培養(yǎng)：觀察消毒劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有無(wú)影響。

在確定了中和劑與中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響后，進(jìn)行正式試驗(yàn)。

5.5.2.2 正式試驗(yàn)分組

a) 中和劑+病毒懸液/病毒載體→接種細(xì)胞培養(yǎng)：觀察中和劑對(duì)病毒有無(wú)作用。

b) （消毒劑/消毒劑載體+中和劑）+病毒懸液/病毒載體→接種細(xì)胞培養(yǎng)：觀察中和產(chǎn)物，或未被

完全中和的殘留消毒劑對(duì)病毒有無(wú)作用或?qū)z測(cè)方法有無(wú)干擾。

c) 病毒懸液/病毒載體→接種細(xì)胞培養(yǎng)：觀察病毒是否可致細(xì)胞病變，并將該組病毒滴度對(duì)數(shù)值

作為陽(yáng)性對(duì)照值。

d) 未接種病毒的細(xì)胞→培養(yǎng)：觀察細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常。

5.5.3 操作步驟

5.5.3.1 懸液法中和劑鑒定試驗(yàn)

a) 第 1 組。試驗(yàn)體系中按病毒與中和劑（1︰4 體積比例）進(jìn)行試驗(yàn)。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于

試管內(nèi)，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取中和劑溶液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以

細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4

孔。置化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃,5%±1% 化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。

b) 第 2 組。試驗(yàn)體系中按病毒與中和產(chǎn)物（1︰4 體積比例）進(jìn)行試驗(yàn)。吸取 0.2 mL 病毒混懸液

于試管內(nèi)，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取中和產(chǎn)物溶液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，

以細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種

4 孔。置化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。

c) 第 3 組。試驗(yàn)體系中按病毒與細(xì)胞維持液（1:4 體積比例）進(jìn)行試驗(yàn)。吸取 0.2 mL 病毒混懸

液于試管內(nèi)，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取細(xì)胞維持液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，

d) 第 4 組。將試驗(yàn)用細(xì)胞，加細(xì)胞維持液后置化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 化碳）

中培養(yǎng)。

5.5.3.2 載體法中和劑鑒定試驗(yàn)

a) 第 1 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入中和劑 1.0 mL，作用 10 min。充分洗

脫，以細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度

接種 4 孔。置化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。

b) 第 2 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入中和產(chǎn)物溶液(染有消毒劑的載體+中和

劑,作用 10 min)1.0 mL，混合均勻。充分洗脫，以細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100

μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4 孔。置化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±

1% 化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。

c) 第 3 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入細(xì)胞維持液 1.0 mL，充分洗脫，以細(xì)胞

維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4 孔。

置化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。

d) 第 4 組。將試驗(yàn)用細(xì)胞，加細(xì)胞維持液后置化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃,5%±1%化碳）

5.5.3.3 結(jié)果判定

試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測(cè)中和劑可判為合格:

a) 第 1、2、3組病毒生長(zhǎng)與原接種量相近；

b) 第 4 組細(xì)胞生長(zhǎng)正常；

c) 中和劑和中和產(chǎn)物，在正式試驗(yàn)的濃度下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響；

d) 連續(xù) 3 次試驗(yàn)取得合格評(píng)價(jià)。

5.6 病毒滅活試驗(yàn)

5.6.1 試驗(yàn)原理

用細(xì)胞感染法測(cè)定消毒因子作用前后（或?qū)φ战M與實(shí)驗(yàn)組）樣本中病毒的量。以細(xì)胞病變作為判斷

指標(biāo)，確定各組病毒的感染滴度，觀察消毒因子對(duì)新型冠狀病毒的滅活效果。

5.6.2 懸液法病毒滅活試驗(yàn)

5.6.2.1 操作步驟

a) 取待測(cè)消毒劑，用硬水稀釋至所需濃度的 1.25倍，于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。

b) 病毒懸液的制備：取出-80℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與有機(jī)干擾物按照1：

1 比例混合作為消毒劑滅活試驗(yàn)用病毒懸液。

c) 消毒試驗(yàn)：取上述病毒懸液 1份加入 4 份待檢消毒劑，立即混勻并記時(shí)。作用至規(guī)定時(shí)間，立

即取出 0.1 mL，加入經(jīng)鑒定合格的 0.9 mL 中和劑中混勻；或用經(jīng)鑒定合格的除法處理。

d) 對(duì)照組試驗(yàn)：陽(yáng)性對(duì)照組為病毒對(duì)照組，觀察病毒生長(zhǎng)是否良好，病毒滴度是否達(dá)到試驗(yàn)要求；

陰性對(duì)照組用細(xì)胞維持液作為陰性對(duì)照，觀察有無(wú)污染，細(xì)胞生長(zhǎng)是否良好。

e) 以上各組按照終點(diǎn)稀釋法分別進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù) 3 次。

f) 終點(diǎn)稀釋法：用細(xì)胞維持液對(duì)待滴定樣本做 10倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)

胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養(yǎng)板，更換細(xì)胞

維持液。繼續(xù)放入化碳培養(yǎng)箱中（36℃±1 ℃,5%±1% 化碳）培養(yǎng) 3-4 天，顯微鏡

下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄細(xì)胞病變情況。

5.6.2.2 結(jié)果判定

試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，可判為合格：

a) 陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)正常；

b) 陽(yáng)性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥5.0；

c) 消毒試驗(yàn)組細(xì)胞無(wú)病變，與陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)情況一致。

5.6.3 載體法病毒滅活試驗(yàn)

5.6.3.1 操作步驟

a) 取待測(cè)消毒劑，置于 20℃±1 ℃水浴中備用。

b) 病毒載體的制備：取載體片，滴染新型冠狀病毒晾干備用。

c) 消毒試驗(yàn)：取病毒載體置于消毒因子，作用至規(guī)定的時(shí)間后取出放入經(jīng)鑒定合格的中和劑或洗

脫液 1.0 mL 中，作用 10 min,混勻洗脫。消毒器械載體布點(diǎn)應(yīng)置于*難殺滅部位，具體方法

參照《消毒技術(shù)規(guī)范》。

維持液。繼續(xù)化碳培養(yǎng)箱中（36℃±1 ℃,5%±1% 化碳）培養(yǎng) 3-4 天，顯微鏡下觀

察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄細(xì)胞病變情況。

5.6.3.2 結(jié)果判定

b) 陽(yáng)性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥4.0；

c) 消毒試驗(yàn)組細(xì)胞無(wú)病變，與陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)情況一致。

6 結(jié)果評(píng)價(jià)

同時(shí)符合下列a)和b)的消毒因子判為消毒效果合格：

a) 去除殘留消毒劑效果的中和劑鑒定試驗(yàn)合格；

b) 懸液滅活試驗(yàn)，每次試驗(yàn)對(duì)新型冠狀病毒應(yīng)有效滅活，陽(yáng)性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥5.0或

載體滅活試驗(yàn)，每次試驗(yàn)對(duì)新型冠狀病毒應(yīng)有效滅活，陽(yáng)性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥4.0。

7 注意事項(xiàng)

7.1實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格按照 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程要求做好個(gè)人防護(hù)。建議參與實(shí)驗(yàn)的人

員進(jìn)行新型冠狀病毒疫苗接種。

7.2涉及新型冠狀病毒活病毒的操作應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室的生物安全相關(guān)規(guī)定。

7.3無(wú)菌器材使用前需檢查包裝是否完整，有破損者不得使用。

7.4消毒試驗(yàn)所用的細(xì)胞培養(yǎng)基和試劑等均需無(wú)菌。

7.5實(shí)驗(yàn)活動(dòng)涉及新型冠狀病毒活病毒的操作，應(yīng)在 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

若發(fā)生溢灑等意外情況時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照 BSL-3實(shí)驗(yàn)室意外情況應(yīng)急處置操作規(guī)程等進(jìn)行安全處置。

7.6實(shí)驗(yàn)廢棄物應(yīng)按照相應(yīng)廢棄物處置操作規(guī)程進(jìn)行安全處置。

 

國(guó)家衛(wèi)生處理安全及適用性檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在系統(tǒng)內(nèi)率先建立新guan病毒消毒效果實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)技術(shù)能力

據(jù)悉，目前該實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力已涵蓋市場(chǎng)上所有消毒產(chǎn)品所涉及的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，能通過(guò)通行標(biāo)準(zhǔn)，為市場(chǎng)緊缺的低溫消毒劑和冷庫(kù)專用消毒設(shè)備提供測(cè)試和效果鑒定，具備滅活技術(shù)先進(jìn)、質(zhì)量數(shù)據(jù)可靠、檢測(cè)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)消毒領(lǐng)域綜合檢測(cè)實(shí)力*強(qiáng)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)之一。

有產(chǎn)品檢測(cè)需求，可以與我們聯(lián)系。

      聯(lián)系人：鄒工

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